綠原酸對人骨肉瘤MG63細胞生物學行為的影響

何家恒，張雨，劉波，施勤，羅宗平

1.蘇州大學 附屬第一醫院骨科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學 骨科研究所，江蘇 蘇州 215006

骨肉瘤是好發于兒童和青少年的惡性腫瘤[1]， 起源于間質細胞系，是骨惡性腫瘤中最多見的一種。腫瘤迅速生長引起全身免疫反應的減弱，臨床主要表現為避痛性跛行、關節活動受限和肌肉萎縮等癥狀，死亡率較高。對骨肉瘤治療的研究是全球關注的焦點。目前臨床骨肉瘤治療以手術治療為主[2]，通過切除病變部位并結合放化療達到根治病變的目的,但是患者將承受巨大的手術風險，并有可能造成嚴重的家庭及社會經濟負擔。因此，尋找一種能夠緩解甚至治愈骨肉瘤的藥物對于改善骨肉瘤患者的預后具有重大意義。

多酚類物質近年來被研究者廣泛關注，研究表明其有著抗菌、抗氧化、抗骨質疏松[3]以及抗腫瘤的作用。在本實驗中，我們探討了多酚類物質綠原酸[4]對骨肉瘤細胞MG63 的增殖、腫瘤細胞干性、侵襲、遷移及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人骨肉瘤細胞株MG63（蘇州大學附屬第一醫院惠贈）；高糖培養基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；TRIzol 總 RNA 提取液、CCK-8 試劑盒、結晶紫染色劑（碧云天公司）；綠原酸（Sigma Aldrich 公司）；Transwell 小室（Corning公司）；Annexin-V FITC 凋亡試劑盒（BD Pharmin?geen 公司）；倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器廠）；CO2培養箱、臺式離心機、全波長酶標儀（Thermo公司）；流式細胞儀（Millipore 公司）；熒光定量PCR 儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 細胞培養方法

將人骨肉瘤細胞株MG63 接種于細胞培養板，用含10%胎牛血清的高糖培養基在37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養，采用0.25%的胰酶進行細胞傳代，倒置顯微鏡實時觀察細胞形態，當達到所需細胞數時進行實驗。

1.3 細胞增殖檢測

用CCK-8 試劑盒檢測MG63 細胞的增殖。CCK-8 試劑盒中的WST-8 試劑可以被細胞線粒體內的脫氫酶還原生成橙黃色甲臜，細胞數目越多則顏色越深。在HDMEM 細胞培養基中按10%比例加入CCK-8 溶液混勻后，每孔均勻加入等量上述溶液（96 孔板），37℃培養箱中孵育2 h，轉移反應后的液體至新的培養板中。用全波長酶標儀測定D450nm值，D450nm值與細胞數量呈正相關。

1.4 細胞侵襲實驗

將對照組及干預后的細胞用含2%胎牛血清的培養基重懸，計數，所需細胞密度為5×105/mL。每塊 24 孔板的 Transwell 上室只加入 100 μL 細胞懸液，下室加入800 μL 含10%胎牛血清的培養基，放入培養箱培養24 h 后取出Transwell 小室，吸去小室中的培養液，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細胞。用PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，用PBS 清洗后在顯微鏡10 倍和40 倍物鏡下觀察，用ImageJ 軟件分析每張照片遷移的細胞數。

1.5 劃痕實驗

用含10%胎牛血清的培養基重懸細胞，接種至6 孔培養板中，待細胞長滿。6 孔培養板底預先用黑筆劃3 條橫線，用200 μL 的槍頭垂直于孔板劃3 條豎線，使其與底部3 條橫線相互垂直。用PBS 洗滌被刮下的細胞，加入培養基，顯微鏡下觀察并拍照。選擇0、12、24 h 為拍攝時間點，觀察細胞的遷移面積。

1.6 RT-PCR

用TRIzol 總RNA 提取液提取對照組和實驗組MG63 細胞的總RNA，測定濃度，將1 μg RNA逆轉錄為cDNA，在PCR 板上加樣擴增，依據公式2-ΔΔCt計算目的基因相對于對照組的表達量［ΔΔCt=（Ct 靶基因-Ct 內參）實驗組-（Ct 靶基因-Ct內參）對照組］。實驗使用的引物序列見表1。

1.7 細胞凋亡檢測

收集培養皿內培養基，PBS 清洗細胞后用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細胞，1500 r/min 離心5 min，棄上清后用PBS 洗滌細胞后離心。用凋亡試劑盒緩沖液重懸細胞，每管加入5 μL Annex?in-V FITC 及碘化丙啶（PI）染液10 μL，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測樣品。

表1 引物序列

1.8 數據分析

所有數據以x±s表示，應用 SPSS13.0 軟件進行數據分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，全部統計檢驗均為雙側概率檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 綠原酸抑制MG63細胞增殖

用CCK-8 試劑盒檢測細胞的增殖，結果顯示和正常條件生長的細胞相比，綠原酸干預后的第3 d 開始細胞增殖顯著降低（P＜0.05，圖1）。

2.2 綠原酸抑制腫瘤干性相關基因的表達

實驗所用的MG63 骨肉瘤細胞的干細胞的標志物包括Sox2 及核干細胞因子（Nucleostemin）基因。MG63 骨肉瘤細胞經綠原酸處理5 d 后進行基因檢測，處理組細胞的腫瘤干性基因較正常生長細胞均有不同程度的降低（P＜0.05）（圖2），表明綠原酸處理抑制了MG63 腫瘤干細胞相關基因的表達。

2.3 綠原酸抑制MG63細胞侵襲及遷移

圖1 綠原酸對MG63 細胞增殖的影響

圖2 綠原酸對MG63 細胞腫瘤干性基因Sox2 及 Nucleostemin 表達的影響

用Transwell 培養板模擬腫瘤細胞侵襲，比較Transwell 孔的上下室內細胞數量及細胞的遷移能力。細胞劃痕實驗是檢測細胞遷移能力的一種方式，主要通過在培養皿上種植的細胞中劃出一道寬度相同的空隙，來模擬細胞在體外遷移的過程，通過比較空隙恢復情況來確定細胞的遷移速率。Transwell 結果（圖3）顯示，實驗組侵襲到下室的細胞數量明顯減少（P＜0.05），表明綠原酸抑制了MG63 細胞的侵襲性。劃痕實驗（圖4）中正常生長細胞的“傷口”已基本愈合，然而在綠原酸的作用下MG63 細胞還留有較大空隙，說明綠原酸抑制了骨肉瘤MG63 細胞的遷移性。

2.4 綠原酸下調抗凋亡基因Bcl-2表達，促進MG63細胞的凋亡

圖3 Transwell 細胞侵襲實驗檢測綠原酸對MG63 細胞侵襲性的影響

圖4 細胞劃痕實驗檢測綠原酸對MG63 細胞遷移性的影響

綠原酸干預 MG63 細胞 3 d 后，Bcl-2 的表達量減少（P＜0.05），而Bax 的表達則無明顯統計學差異（P＞0.05）（圖5）。用 PI 染色細胞核酸，PI 不可透過細胞膜，根據染色情況可判斷膜的完整性，區分壞死細胞、凋亡細胞和活細胞。PI 和An?nexin-V 聯合可以分辨活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。圖6 的Q3 區域為凋亡細胞陽性區域，此結果表明綠原酸處理后的細胞凋亡比例更高（P＜0.05）。

3 討論

骨肉瘤是起源于間充質細胞的具有高度侵襲性的惡性腫瘤，其特征為增殖的腫瘤細胞直接形成未成熟骨或骨樣組織。目前針對骨肉瘤的治療方法大多以手術根治性治療聯合藥物化療為主，但藥物化療副作用明顯，且腫瘤細胞易對化療藥物產生耐藥[5]，嚴重影響了患者的生活質量，限制了患者的預后生存，因此尋找毒副作用小且不易產生耐藥的物質用于治療骨肉瘤，對于臨床上改善患者預后具有重大意義。本實驗中所用的綠原酸是從植物體內提取的多酚類物質，在一定程度上可避免副作用的發生。我們通過研究綠原酸對人骨肉瘤MG63 細胞生物學行為的影響，進而探索綠原酸在骨肉瘤臨床治療中的應用價值。

圖5 綠原酸對MG63 細胞凋亡相關基因表達的影響

腫瘤干細胞是一類具有自我更新、無限增殖和巨大分化潛能的細胞。當腫瘤干細胞不受控制時，可以無限增殖和轉移。通過對腫瘤細胞干性基因的檢測，可以對腫瘤細胞的增殖和轉移能力有初步的判斷。例如對Sox2 和Nucleostemin 的檢測，Sox2 是Sox 基因家族的一員[6]，表達于胚胎干細胞，在胚胎發育中發揮重要作用；Nucleoste?min[7]是表達于干細胞的干預腫瘤細胞增殖的P53結合蛋白。我們的研究發現，經綠原酸干預后，上述腫瘤干性相關基因的表達下調，雖然兩者基因的表達下降不能明確表明腫瘤干細胞的存在減少，但可證明綠原酸降低了MG63 細胞產生具有腫瘤干細胞特性細胞群的能力。

腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡是一個復雜的病理過程，與腫瘤發生發展密切相關，并且參與遠處器官的轉移。相關研究表明，腫瘤細胞的遷移過程可以視為腫瘤細胞對于人體微環境的適應過程[8]。而腫瘤細胞的侵襲，既可以通過穿過細胞外基質和血管基底膜游走至血管內；又可以與血管內皮細胞相黏附，并穿過血管內皮細胞游走至血管外[9-10]。腫瘤細胞如若侵襲性增強會對機體造成嚴重的傷害，與此同時，腫瘤細胞凋亡的減少會導致細胞的異常增殖[11]，對患者預后產生不良影響。

我們的研究表明綠原酸不僅可以通過降低遷移速率，致使MG63 細胞株無法適應人體微環境，進而導致腫瘤細胞易被機體清除，還能夠通過抑制MG63 細胞株的遷移性及侵襲性，抑制腫瘤細胞的全身擴散。此外，實驗中檢測的Bcl-2和Bax 基因均是Bcl-2 家族成員，在腫瘤細胞凋亡的基因調控過程中起著至關重要的作用[12-13]。抗凋亡基因Bcl-2 經綠原酸干預后表達下降，而Bax的表達未見明顯變化，用凋亡試劑盒檢測細胞凋亡比例，發現經綠原酸處理后的細胞凋亡比例上升，此結果證實綠原酸促進了骨肉瘤MG63 細胞的凋亡。

在后續研究中，我們將檢測更多凋亡相關基因的表達，并對各細胞系的骨肉瘤細胞，如HOS、Saos 等進行研究[14]，更精確全面地闡明綠原酸對骨肉瘤細胞凋亡的影響，對相關的凋亡機制也應做進一步探索，以期為臨床治療骨肉瘤，開發新的藥物提供理論基礎。

綜上所述，綠原酸可以降低MG63 細胞的腫瘤細胞干性，抑制骨肉瘤細胞MG63 的增殖、侵襲和遷移，并且促進MG63 骨肉瘤細胞凋亡。這對骨肉瘤的疾病進程以及治療有重要意義，未來有望成為治療骨肉瘤的有效藥物。