意大利蒼耳提取物抗植物病原真菌活性研究

何源 齊浩 阿力米熱·庫來西 張博 迪麗妮尕·艾斯卡爾 潘樂

摘要?[目的]研究意大利蒼耳提取物抗植物病原真菌活性，為植物資源的利用及植物源農藥的開發提供研究基礎。[方法]以意大利蒼耳（Xanthium italicum Moretti）全草為原料，經90%乙醇超聲輔助提取后，分別用不同溶劑進行萃取得到石油醚相、氯仿相和乙酸乙酯相。采用菌絲生長速率法研究各相對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、茄交鏈孢（Alternaria solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium Oxysporum）、鏈格孢（Alternaria alternata）等植物病菌的抑菌活性。[結果]3種萃取相對4種植物病原真菌均具有顯著抑制且呈濃度依賴性，其中氯仿萃取相對4種植物病原真菌抑制效果最好，當濃度為800 μg/mL時抑制率均達50%以上。對灰葡萄、孢鏈格孢、尖孢鐮刀菌和茄交鏈孢的EC50 分別為788.36、566.93 、496.48 、339.39 μg/mL。[結論]意大利蒼耳萃取相中，氯仿相對供試真菌抑制作用顯著，活性成分主要集中在中低極性部位。該研究為從意大利蒼耳次生代謝物中發掘活性先導化合物和植物源農藥的創制提供了理論依據。

關鍵詞?意大利蒼耳提取物，抗真菌活性，抑制作用

中圖分類號?S482.2+92文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）06-0119-03

Abstract?[Objective]To ?research activity of extracts of Xanthium italicum Moretti against plant pathogenic fungi，and provide ?research basis for the utilization of plant resources and the development of plantderived pesticides.[Method]Xanthium italicum Moretti was used as the raw material，and after ultrasonic extraction with 90% ethanol，the extract was extracted with different solvents to obtain petroleum ether phase，chloroform phase and ethyl acetate phase.The antibacterial activity of each plant pathogen such as Botrytis cinerea，Alternaria solani，Fusarium Oxysporum，and Alternaria alternata was studied by mycelial growth rate method.[Result]Three extracts exhibited antifungal activity against four plant pathogenic fungi with concentrationdependent inhibition.Among them，chloroform extract showed the strongest inhibition against the four plant pathogenic fungi at the concentration of 800 μg/mL.When the EC50 values on Botrytis cinerea，Alternaria solani，Fusarium Oxysporum Alternaria alternata were 788.36，566.93 496.48 and 339.39 μg/mL.[Conclusion]The extract of Xanthium italicum，chloroform has a significant inhibitory effect on the tested fungi，and the active ingredients are mainly concentrated in the middle and low polarity parts.This study provides a basis for the discovery of active lead compounds and plantderived pesticides from the secondary metabolites of Xanthium italicum.

Key words?Xanthium italicum Moretti wholegrass extract，Antifungal activity，Inhibition effect

意大利蒼耳（Xanthium italicum Moretti）為菊科蒼耳屬（Xanthium L）一年生草本植物[1-2]。1991年9月在北京市昌平區首次報道，成為我國主要的入侵植物之一[3]。近年來，意大利蒼耳在新疆地區快速繁殖蔓延，成為該地區主要入侵植物。該種傳播速度快、散布范圍廣、長勢猛、體型大，幼苗有毒，牛、羊等牲畜不食，對當地的農業和畜牧業造成了嚴重危害，但由于其生物量巨大、植物資源豐富，且表現出很強的化感作用，表現出顯著的殺蟲、抑菌作用[4-6]。因而，其在農業病蟲害防治方面的研究引起廣泛關注。新疆是我國重要的糧食與林果產區，但近年來灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、鏈格孢（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（Fusarium Oxysporum）、茄交鏈孢（Alternaria solani）等暴發頻繁、危害嚴重，成為主要的病原真菌。2009年在阿克蘇、和田地區首次發現由鏈格孢引起的棗果黑斑病，次年該病在阿克蘇爆發使新疆兵團第一師的商品果產量損失超過30%，2015和2016年，南疆紅棗再次因該病造成了嚴重損失[7-8]。王成軍等[9]在新疆石河子等地區調研發現，由灰葡萄孢引起的灰霉病會導致番茄減產20% ～ 40%，黃瓜減產30% ～ 50% ，西葫蘆減產10% ～ 30%。由尖孢鐮刀菌侵染引起的根腐病已經給新疆農業生產帶來了巨大損失，在新疆阿爾泰地區由于大豆連作，根腐病大面積發生、造成大面積減產和200 hm2絕收[10]，因此篩選出高效、安全的防治藥劑，對于降低病害發生，提高產量具有重要意義。研究者針對蒼耳屬植物的抗菌殺蟲作用發現較早，丁維成等[11]采用菌絲生長速率法研究發現蒼耳葉丙酮提取物對21種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用其中對水稻惡苗病菌、玉米頂腐病菌、水稻稻瘟病菌及小麥根腐病菌活性最好，王旭等[12]對蒼耳提取物Ⅱ柱層析分離后發現，棕櫚酸、十八烷酸流分對植物病原菌黃瓜枯萎、黃瓜黑星病菌有較強的抑制作用，張君霞等[13]研究發現蒼耳氯仿提取物對蘿卜蚜有很強的忌避作用、觸殺作用，對黏蟲具有拒食和生長發育抑制作用。但目前，對意大利蒼耳抗菌活性的研究很少。筆者以意大利蒼耳提取物為研究對象，采用超聲輔助法對意大利蒼耳全草進行提取，分別得到氯仿相、乙酸乙酯相和石油醚相，并以灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、茄交鏈孢為對象研究了各相的抗植物病原真菌活性，旨在為意大利蒼耳植物資源的利用及植物源農藥的開發提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試植物：意大利蒼耳 （Xanthium italicum Moretti），2017年7月采集于新疆博爾塔拉蒙古自治州。供試菌株：灰葡萄孢 （Botrytis cinerea）、鏈格孢 （Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌 （Fusarium Oxysporum）、茄交鏈孢 （Alternaria solani）由中國科學院蘭州化學物理研究所化學生態學研究室提供。

1.2?植物提取液的制備

將采集后的意大利蒼耳全草洗凈自然陰干后粉碎，稱取植物粉末，并用90%乙醇浸泡，于室溫超聲振蕩輔助提取，用6層紗布過濾，再用濾紙抽濾2遍除去固體殘渣，濾液合并，旋轉蒸發干燥，得到浸膏[14]。將浸膏用水分散后，依次加入石油醚、氯仿和乙酸乙酯，用力振蕩使其充分混合，靜置分液，此過程重復3次，分別合并石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾濃縮至恒定質量，得到石油醚萃取相、氯仿萃取相，乙酸乙酯萃取相。

1.3?植物提取液抑菌活性測定

采用菌絲生長速率測定法[15]，測定意大利蒼耳的3種萃取相對4種植物病原真菌的毒力。在無菌操作條件下，采用稀釋法在10 mL 50 ～60 ℃的PDA培養基中依次加入不同濃度的植物提取物母液，稀釋成不同梯度的含藥培養基，加入等體積的二甲基亞砜溶液為對照。用直徑7 mm打孔器在菌落邊緣生長一致的部分打制菌餅，將菌餅（有菌絲的面朝下）接種于平板中央，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。采用十字交叉法測定各處理菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率，并進行EC50 計算。

用下列公式計算菌絲生長抑制率：

菌落直徑（mm）= 測量菌落的平均直徑-菌餅直徑

抑制率=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑×100%

2?結果與分析

2.1?抑菌活性?由表1可知，意大利蒼耳全草的3種萃取相對4種病原菌均表現出不同程度的抑菌效果，且呈現濃度依賴性。在同一濃度處理下，意大利蒼耳全草的 3 種提取物對灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌和鏈格孢總體抑菌效果表現為氯仿相 > 石油醚相 > 乙酸乙酯相，對茄交鏈孢抑菌效果表現為氯仿相 > 乙酸乙酯相 > 石油醚相。各萃取相對不同病原真菌的抑制效果不同，有一定的選擇性，當抑菌時間為72 h濃度為800 μg/mL時，氯仿相對4種病原真菌均有較好的抑制作用，抑制率分別為51%、63%、60%、80%。

由表2、3可知，意大利蒼耳全草的3種萃取相對4種病原菌在同一濃度，不同時間處理下呈現的抑菌總趨勢與表1一致。其中灰葡萄孢和茄交鏈孢的抑制率隨著時間的增長，抑制率逐漸下降，尖孢鐮刀菌和鏈格孢的抑制率隨時間呈先增長后下降的趨勢。說明這4種菌對意大利蒼耳全草的3種萃取相具有一定的抑菌活性，灰葡萄孢和茄交鏈孢對意大利蒼耳全草的3種萃取相具有一定的耐藥性。

2.2?相對毒力

由表 4 可知，意大利蒼耳全草3種萃取相對4 種植物病原真菌的EC50 值之間差異顯著，其中氯仿提取物相較于其他2種提取物對灰葡萄孢、茄交鏈孢、尖孢鐮刀菌、鏈格孢抑制效果最強，其 EC50 分別為788.36、566.93、496.48和339.39 μg/mL。石油醚提取物和乙酸乙酯提取物對灰葡萄孢、茄交鏈孢、尖孢鐮刀菌、鏈格孢抑制效果相對較弱，其 EC50 均超過了1 000 μg/mL。說明氯仿提取物抑制效果優于其他2種提取物，意大利蒼耳中主要的抗菌活性物質集中在氯仿相中。

3?討論

意大利蒼耳入侵新疆后嚴重抑制了地蒼耳的生長繁殖，且破壞了本地蒼耳與其他物種間的群落結構關系及生態系統平衡[16]。研究發現，造成本地藥用蒼耳生長分布與資源量減少的重要原因之一，是因為意大利蒼耳總苞果的水提液具有很強的化感作用，可以改變土壤微生物群落結構、土壤酶活性和土壤養分，從而抑制本地蒼耳種子萌發和幼苗生長[17-18]。但目前對意大利蒼耳是否具有同本地蒼耳相同的藥用價值還未知，這些化感作用明顯部位與其抗菌活性的強弱是否有關還有待深入研究。

蒼耳屬中化學成分多種多樣，目前已從中分離得到揮發油類、倍半萜內酯類、甾體類、水溶性苷類、酚酸類等百余種化合物，研究者也對相應的單體化合物進行了活性研究。胡冬燕[19]利用現代色譜技術對蒼耳（Xanthium sibiricum）氯仿萃取相進行分離純化得到蒼耳亭、蒼耳皂素、蒲公英賽醇等11種化合物，并對含量較大的產物蒼耳亭（0.1%）進行抑菌試驗，發現其對辣椒絲核、番茄灰霉病菌有較強的抑制作用。有研究者針對蒼耳（Xanthium sibiricum Patrin.ex Widder）石油醚、乙酸乙酯萃取相也分離得到了蒲公英賽醇、羽扇豆酮、蒼耳亭、蒼耳皂素等化合物并發現這些化合物對蕃茄早疫、黃瓜枯萎、蕃茄灰霉和蘋果腐爛病菌有較好的抑制作用[20]。此外，袁著耕[21]研究發現用不同萃取相對刺蒼耳（Xanthium spinosum L.）果實萃取后氯仿萃取相的化感作用最強，并由此推測氯仿萃取相相較于其他萃取相化感作用物質最多。由此可知，意大利蒼耳經不同溶劑萃取后，其中的活性成分基本相似。但該研究采用梯度萃取，不同極性的活性物質是否富集到了不同極性的萃取溶劑中，還有待進一步分離純化驗證。

意大利蒼耳全草醇提物各萃取相的抗真菌效果具有顯著差異，主要原因是抗菌活性物質經不同極性有機溶劑萃取后富集在不同極性部位，不同極性萃取液中有生物活性的化學成分存在差異。同時發現，各萃取相對不同菌也表現出不同抑制，可能是因為不同植物病原菌生長所需的生長要素以及代謝方式不同所致[22]。該研究為了最大程度地提高提取效率、縮短提取時間的同時不破壞其化感部位，保證提取物中的活性結構不變，采用了超聲輔助溶劑提取法。萃取方法采用的是梯度萃取，但經石油醚、氯仿萃取后，乙酸乙酯萃取出來的東西相對較少，這可能是該試驗氯仿萃取相抑菌效果好，而乙酸乙酯相的抑菌效果相對較差的主要因素之一。研究發現，在蒼耳屬其他種中表現出類似抑制情況，劉文潔[23]研究了蒼耳根（X.sibiricum）提取物對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等的抗菌作用，發現氯仿相對6種菌都有很好的抑制作用，是萃取樣品中抑菌效果最廣的。研究者在蒼耳（X.sibiricum）氯仿萃取相中分離得到了蒼耳亭、蒲公英賽醇、β-谷甾醇、東莨菪內酯等具有顯著抗真菌活性的單體化合物[24-25]，而意大利蒼耳的抗真菌作用是否也因這些化合物引起，將通過進一步分離純化明確其物質基礎。

4?結論

意大利蒼耳作為新疆入侵植物，因為其傳播速度快、散布范圍廣等因素，對地區農牧業的生產造成極大的負面影響，但對其進行植物資源開發利用具有重要意義。該研究通過超聲輔助提取意大利蒼耳經乙醇提取后分別萃取得到石油醚、乙酸乙酯、氯仿3相。通過菌絲生長速率測定法對4種植物病原真菌進行殺菌活性篩選，發現氯仿提取物抑制作用最強，最高抑制率達80%，EC50 達339.39 μg/mL。分析表明，意大利蒼耳全草提取物在植物病原真菌防治方面具有開發潛力，其中以氯仿提取物為最佳。該研究為意大利蒼耳抗病的物質基礎及進一步分離純化奠定了基礎，為新疆蒼耳屬植物資源的開發利用提供理論依據。

參考文獻

[1] 李新芳，孟曉純，買爾當.維藥蒼耳子在國內的應用[J].中國民族醫藥雜志，2008（4）：35.

[2] 國家藥典委員會.中國人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[3] 車晉滇，胡彬.外來入侵雜草意大利蒼耳[J].雜草科學，2007（2）：58-59.

[4] 杜珍珠，徐文斌，閻平，等.新疆蒼耳屬3種外來入侵新植物[J].新疆農業科學，2012，49（5）：879-886.

[5] 邰鳳姣，韓彩霞，邵華.入侵植物意大利蒼耳不同部位揮發油的化感作用及其化學成分的比較分析[J].生物學雜志，2015，32（2）：36-41.

[6] 劉剛.意大利蒼耳中一種毒素有望開發為植物源除草劑[J].農藥市場信息，2012（17）：33.

[7] 何麗，郭開發，艾尼古麗·依明，等.新疆紅棗縮果病和棗果黑斑病病原鑒定[J].石河子大學學報（自然科學版），2017，35（3）：312-318.

[8] 張棟海，李克福，趙思峰.新疆南疆矮化密植棗園三種紅棗病害發生規律及其影響因素研究[J].北方園藝，2015（3）：105-108.

[9] 王成軍，付曉春，王公起.保護地蔬菜灰霉病的發生及防治[J].新疆農墾科技，1998（6）：11.

[10] 王春華，章建新，謝東升，等.新疆大豆根腐病病原及防治技術初報[J].新疆農業大學學報，2004，27（4）：7-11.

[11] 丁維成，紀明山，黃溢，等.蒼耳葉提取物對植物病原真菌的抑菌活性[J].江蘇農業科學，2009（1）：113-114.

[12] 王旭，楊順義，張新虎，等.蒼耳提取物Ⅱ中抑菌成分的分離純化及成分鑒定[J].甘肅農業大學學報，2008（5）：117-121.

[13] 張君霞，張新虎，沈慧敏.蒼耳提取物對蘿卜蚜和粘蟲作用方式及解毒酶活性影響的研究[J].草業學報，2014，23（4）：276-284.

[14] 袁珂，劉延澤，冀春茹.中草藥化學成分研究中幾種不同提取方法的比較研究[J].天然產物研究與開發，1997（4）：57-61.

[15] 王靜，葉敏，范黎明，等.菌絲生長速率法篩選纖維素降解菌的研究[J].中國農學通報，2013，29（33）：323-326.

[16] 王鵬鵬.外來入侵種意大利蒼耳與土著種蒼耳競爭能力的比較研究[D].石河子：石河子大學，2018.

[17] 劉叢彬，何愛芳，吳慧芬，等.蒼耳屬外來入侵植物與本土蒼耳化感作用研究[J].種子，2018，37（8）：4-8.

[18] 邰鳳姣，朱珣之，韓彩霞，等.外來入侵植物意大利蒼耳對土壤微生物群落、土壤酶活性和土壤養分的影響[J].生態科學，2016，35（4）：71-78.

[19] 胡冬燕.蒼耳化學成分的分離、鑒定及抑菌活性的研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2012.

[20] 張文治，栗娜.蒼耳化學成分及生物活性研究[J].高師理科學刊，2016，35（4）：30-32.

[21] 袁著耕.刺蒼耳化感作用及活性成分研究[D].伊犁：伊犁師范學院，2018.

[22] 段燕玲，魏曉璐，任先偉，等.青龍衣提取物的抗真菌和抗腫瘤活性研究[J].食品工業科技，2016，37（13）：77-82.

[23] 劉文潔.蒼耳根化學成分及其藥理活性的研究[D].海口：海南師范大學，2013.

[24] 栗娜.蒼耳化學成分及活性研究[D].齊齊哈爾：齊齊哈爾大學，2016.

[25] 闞素琴，陳光英，江虹，等.蒼耳根化學成分的研究[C]//海南省藥學會.海南省藥學會2009年學術會議論文集.海口：海南省藥學會，2009：4.