應(yīng)用SS-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)種特異性引物快速鑒定瓜實(shí)蠅

黃振 郭瓊霞 陳韶萍

摘要?[目的]為了促進(jìn)果蔬進(jìn)出口貿(mào)易和快速通關(guān)，防止瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]進(jìn)一步傳入擴(kuò)散，迫切需要開展適合實(shí)蠅快速鑒定技術(shù)的研究。[方法]應(yīng)用SS-PCR技術(shù)，基于mtDNA COⅠ序列，設(shè)計(jì)了1對能夠準(zhǔn)確鑒定瓜實(shí)蠅的種特異性引物GF85和GR531。選用瓜實(shí)蠅作為陽性對照，南瓜實(shí)蠅[B.tau（Walker）]、具條實(shí)蠅[B.scutellata（Hendel）]等其他19種待測實(shí)蠅作為陰性對照，提取供試蟲樣基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測。[結(jié)果]僅蟲樣瓜實(shí)蠅能在約447 bp位置擴(kuò)增出一條清晰且單一的條帶，其余的蟲樣未出現(xiàn)條帶。[結(jié)論]將該試驗(yàn)建立的SS-PCR鑒定方法應(yīng)用于實(shí)際進(jìn)出境果蔬截獲和疫情監(jiān)測的蟲樣的鑒定，并得到驗(yàn)證，表明該方法具特異性、穩(wěn)定性強(qiáng)，可在實(shí)際的實(shí)蠅鑒定工作中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞?瓜實(shí)蠅，mtDNA COⅠ，種特異性引物，SS-PCR，快速鑒定

中圖分類號?S433文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）06-0083-04

Abstract?[Objective]In order to promote the import and export trade of fruits and vegetables and rapid customs clearance，prevent further damage from Bactrocera cucurbitae（Coquillett），there is an urgent need to develop a rapid identification technology suitable for the fly.[Method]A pair of primers， GF85 and GR531， was designed and synthesized based on the mtDNA CO I sequence.B.cucurbitae（Coquillett） was chosen as the positive control and other 19 species of fruit flies including B.tau （Walker），B.scutellata （Hendel） and so on were used as the negative controls， for the PCR amplification and gel electrophoresis.[Result]Clear and single 447 bp band was amplified only in B.cucurbitae（Coquillett），but not in the other 19 fruit flies.[Conclusion]The SSPCR identification method established in this experiment has been applied and verified in inspection and quarantine， indicating that this method has high species specificity and can be applied in infestation monitoring and quarantine surveillance of fruit flies in ports.

Key words?Bactrocera cucurbitae（Coquillett），mtDNA COI，Speciesspecific primers，Speciesspecific PCR （SSPCR），Rapid identification

瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]是我國進(jìn)境果蔬中的重要檢疫性害蟲，隸屬于雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Tephritidae）果實(shí)蠅屬（Bactrocera）。1913年，瓜實(shí)蠅在印度被 Bezzi 首次報(bào)道，目前分布于亞洲的巴基斯坦、尼泊爾、斯里蘭卡、菲律賓、中國以及其他東南亞國家和地區(qū)，非洲的喀麥隆、埃及、肯尼亞、毛里求斯、坦桑尼亞等國家，大洋洲的澳大利亞、新幾內(nèi)亞、馬里亞納群島和夏威夷群島、所羅門群島、羅塔、關(guān)島群島、瑙魯以及南太平洋島嶼和美國南部[1]。在中國，主要分布在西南、華南、華東的部分地區(qū)以及臺灣、香港等地區(qū)[2]。瓜實(shí)蠅寄主范圍很廣，主要有番石榴、桃、無花果、甜瓜、西瓜、辣椒、菜豆、苦瓜、南瓜和番茄等葫蘆科和茄科等植物，為害種類超過120種[3]。

近年來，由于國際貿(mào)易日漸頻繁，合作領(lǐng)域不斷拓寬，進(jìn)境果蔬種類、數(shù)量不斷增加，給瓜實(shí)蠅的進(jìn)一步傳入帶來了潛在危險(xiǎn)[4～5]，而在進(jìn)境果蔬中截獲到的實(shí)蠅均為幼蟲、卵或蛹，從外觀形態(tài)往往難以對其進(jìn)行正確的種類識別。為了促進(jìn)果蔬進(jìn)出境貿(mào)易，加快口岸通關(guān)速度，以及疫情監(jiān)測中實(shí)蠅蟲樣的快速鑒定，亟需開展實(shí)蠅的快速鑒定識別技術(shù)。

應(yīng)用SS-PCR分子生物學(xué)技術(shù)快速鑒定害蟲種類，不僅能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的問題，而且不受卵、幼蟲、蛹等不同蟲態(tài)和蟲體組織的影響。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛運(yùn)用于昆蟲的鑒定中[6-7]。目前，線粒體DNA mtDNA CO Ⅰ 被越來越多地應(yīng)用于實(shí)蠅近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究中[8-9]。

為了實(shí)現(xiàn)對口岸截獲的疑似瓜實(shí)蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及蟲體組織的準(zhǔn)確鑒定，筆者基于SS-PCR（speciesspecific PCR）技術(shù)，擬篩選設(shè)計(jì)種特異引物快速鑒定瓜實(shí)蠅的方法，應(yīng)用于口岸的實(shí)際檢疫和疫情監(jiān)測。

將GF85和GR531利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，最終將正向引物GF85的第8個堿基A顛換成T，第11個堿基A轉(zhuǎn)換成G，第17個堿基T顛換成A，反向引物GR531的第2個堿基T轉(zhuǎn)換成C，第3、4個堿基C轉(zhuǎn)換成T，確定出引物GF85和GR531（圖2）。

2.3?引物種特異性與靈敏度

2.3.1?引物種特異性。

通過對選擇的GF85和GR531種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明只有陽性對照瓜實(shí)蠅在約447 bp的位置擴(kuò)增出了一條清晰且明顯透明的條帶，其余19種供試的實(shí)蠅均未見任何目標(biāo)條帶，試驗(yàn)重復(fù)3次結(jié)果一致，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的GF85和GR531種特異性引物有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性（圖3）。

將試驗(yàn)所獲得的PCR產(chǎn)物通過英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，將結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，試驗(yàn)表明該段序列與數(shù)據(jù)庫中的瓜實(shí)蠅序列完全一致。

2.3.2?引物靈敏度。

采用核酸蛋白分析儀對提取的瓜實(shí)蠅DNA模板的濃度進(jìn)行測試，濃度為21.62 ng/μL。取DNA模板的不同濃度測定最低檢出閾值，結(jié)果表明模板濃度降低，擴(kuò)增出的條帶呈逐漸變淡的趨勢，稀釋至10-1倍后，仍可見有明顯條帶，表明該方法具有較高的靈敏度（圖4）。

2.4?方法與驗(yàn)證

采用SS-PCR快速鑒定瓜實(shí)蠅的方法，鑒定從福建口岸進(jìn)境的水果中截獲的瓜實(shí)蠅蟲樣21份，均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖5），結(jié)果表明該試驗(yàn)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果一致，所以應(yīng)用SS-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)種特異性引物快速鑒定瓜實(shí)蠅方法具有較好的穩(wěn)定性，能夠在檢疫鑒定工作中準(zhǔn)確鑒定出瓜實(shí)蠅，并可作為口岸進(jìn)出境果蔬檢疫和實(shí)蠅疫情監(jiān)測鑒定工作的重要依據(jù)。

3?討論

3.1?實(shí)蠅的快速鑒定是困擾口岸檢疫人員的突出問題

實(shí)蠅類害蟲種類的快速鑒定是檢驗(yàn)檢疫的重要工作，也是困擾口岸檢疫人員的突出問題。實(shí)蠅類害蟲是果蔬的重要害蟲，在口岸進(jìn)境的果蔬中經(jīng)常被截獲到的多為其卵、幼蟲、蛹。目前傳統(tǒng)果實(shí)蠅屬昆蟲的識別主要以成蟲的形態(tài)特征為重要鑒定依據(jù)，成蟲前各個時(shí)期的蟲態(tài)（卵、幼蟲、蛹）的鑒定特征不穩(wěn)定或不明顯，無法進(jìn)行快速鑒定，直接影響果蔬進(jìn)出口貿(mào)易和快速通關(guān)。

3.2?引物的特異性是快速準(zhǔn)確鑒定種類的關(guān)鍵

以分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢疫性害蟲種類鑒定的研究開發(fā)不受昆蟲發(fā)育時(shí)期、殘?bào)w的影響。昆蟲分子的快速鑒定研究、發(fā)展與應(yīng)用為檢疫害蟲的及時(shí)鑒定提供了快捷而準(zhǔn)確的途徑，有效促進(jìn)果蔬貿(mào)易快速通關(guān)，防止檢疫性實(shí)蠅傳入以及進(jìn)一步傳播擴(kuò)散的前提。張長禹[9]利用3種分子標(biāo)記對瓜實(shí)蠅、柑橘大實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、具條實(shí)蠅這5種實(shí)蠅的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析與分子快速鑒定研究，但因?yàn)榉肿訕?biāo)記技術(shù)對環(huán)境因子變化較為敏感，擴(kuò)增產(chǎn)物的可重復(fù)性相對較差，結(jié)果的可靠性低，因此目前已較少使用。該試驗(yàn)建立的SS-PCR技術(shù)由CO I ?標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)化而來，具有重現(xiàn)性強(qiáng)、譜帶單一等優(yōu)點(diǎn)，適宜于大規(guī)?？焖贆z測分析。該試驗(yàn)選用mtDNA CO Ⅰ作為標(biāo)記基因[10]，選擇與瓜實(shí)蠅序列較為一致的8種實(shí)蠅的同源序列，設(shè)計(jì)了能快速鑒定出瓜實(shí)蠅的特異性引物。采用該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物GF85和GR531對供試的20種實(shí)蠅進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅瓜實(shí)蠅能擴(kuò)增出一條長度約447 bp的單一且清晰的目標(biāo)條帶，其余的實(shí)蠅種類均無一條帶出現(xiàn)，同時(shí)，通過對截獲的瓜實(shí)蠅的幼蟲、蛹和飼養(yǎng)的成蟲以及部分蟲樣的驗(yàn)證，其均與成蟲形態(tài)分類結(jié)果一致，GF85和GR531引物能特異地鑒定出瓜實(shí)蠅。該試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物的特異性試驗(yàn)表明盡管截獲的是卵、幼蟲、蛹或是殘?bào)w，只要能提取到微量DNA，就能快速準(zhǔn)確地鑒定到種。所以，SS-PCR檢測鑒定方法的靈敏度至關(guān)重要。

3.3?SS-PCR方法可用于瓜實(shí)蠅的特異鑒定?試驗(yàn)所建立的SS-PCR鑒定瓜實(shí)蠅的方法具有快速簡便、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能檢測到的DNA模板濃度可低至2.162 ng/L。同時(shí)，該SS-PCR檢測鑒定方法在實(shí)際檢疫工作中也得到應(yīng)用和驗(yàn)證。此外，SS-PCR分析技術(shù)操作簡便快捷，縮短了通關(guān)時(shí)間，提高了工作效率。因此，該技術(shù)方法可用于瓜實(shí)蠅的特異鑒定，并在害蟲檢疫與檢測監(jiān)測中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] PRABHAKAR C S，MEHTA P K，SOOD P，et al.Population genetic structure of the melon fly， Bactrocera cucurbitae （Coquillett）（Diptera： Tephritidae） based on mitochondrial cytochrome oxidase （COI） gene sequences[J].Genetica， 2012， 140（1/2/3）： 83-91.

[2] 梁廣勤，楊國海，梁帆，等.亞太地區(qū)寡毛實(shí)蠅[M].廣州：廣東科技出版社，1996：222-223.

[3] 歐劍峰，黃鴻，吳華，等.瓜實(shí)蠅國內(nèi)研究概況[J].長江蔬菜，2008（13）：33-37.

[4] 黃振，黃可輝.檢疫性害蟲——瓜實(shí)蠅在中國的適生性研究[J].武夷科學(xué)，2013，29（1）：177-181.

[5] 黃振.果實(shí)蠅屬重要種的鑒定、人工飼料篩選、適生性預(yù)測和風(fēng)險(xiǎn)分析[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2010.

[6] 陳韶萍，黃振，郭瓊霞，等.實(shí)蠅類害蟲分子鑒定研究進(jìn)展 [J].生物安全學(xué)報(bào)，2014，23（3）：151-155.

[7] 黃可輝， 郭瓊霞， 虞赟， 等.分子標(biāo)記法在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用[J].華東昆蟲學(xué)報(bào)， 2005， 14（2）： 109-114.

[8] JAMNONGLUK W， BAIMAI V，KITTAYAPONG P.Molecular evolution of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based ?on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica，2003，119：19-25.

[9] 張長禹.五種實(shí)蠅的分子系統(tǒng)發(fā)育分析與分子快速鑒定研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[10] 黃振，陳韶萍，謝婧，等.應(yīng)用種特異性PCR技術(shù)快速鑒定辣椒實(shí)蠅[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2015，58（4）：460-466.