大量提取羊草基因組方法的優化

石雅麗 張麗萍 趙一方 李榕珊 蘭輝 孫亞超 龐中緣 陳薇薇 張朋 任紅洋

摘要?羊草是我國北方草原上廣泛分布的一種禾本科牧草，其對畜牧業及生態環境有著至關重要的作用，其中，獲得大量完整的羊草基因組是進行羊草分子生物學研究的基礎。首先對常用的提取植物基因組DNA方法及其原理進行歸納分析，然后利用常用的吸附柱法、改良SDS法和改良CTAB法，分別對羊草基因組進行大量提取。結果發現，改良的CTAB法在大量提取時需要用50 mL離心管，離心轉速選取5 000 r/min時基因組斷裂較少，同時最終用毛細管將基因組DNA挑出來，既提高了DNA的產率又保證了DNA的完整性，同時提高了純度。

關鍵詞?羊草，基因組DNA，CTAB法，SDS法

中圖分類號?S188文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）06-0080-03

Abstract?Leymus chinensis is a grass species that is widely distributed on grasslands in northern China. It plays a vital role in animal husbandry and the ecological environment.Obtaining a large number of complete genomes is the basis for molecular biology research of L.chinensis.Firstly，the commonly used methods for extracting plant genomic DNA were summarized and analyzed. Then， the common adsorption column method，improved SDS method and CTAB method in this laboratory were used to extract a large number of L. chinensis genomes.The results showed that the improved CTAB method required a 50 mL centrifuge tube for largescale extraction. The genomic DNA was less broken when the centrifugation speed was selected at 5 000 r/min. At the same time，the genomic DNA was finally picked out with a capillary， which not only improved the DNA yield，but also ensured the integrity of the DNA， and improved the purity.

Key words?Leymus chinensis，Genomic DNA，CTAB method，SDS method

羊草[Leymus chinensis （Trin.）Tzvel.]是我國北方草原上廣泛分布的一種禾本科牧草，其耐干旱﹑耐鹽堿且適口性較好，在畜牧業及生態環境方面都有著重要的經濟價值。科學家們已經對羊草開展了基因組測序﹑親緣關系分析和抗旱耐鹽堿分子機理的研究。其中，基因組DNA的純度﹑完整性與產量都直接關系著下游試驗結果，獲得大量高質量的羊草基因組DNA是進行上述分子生物學研究的重要基礎。

植物材料具有堅韌的細胞壁，且有些植物材料富含多糖類和多酚類等次級衍生物，這些都會影響基因組DNA的質量與產量[1]。對于不同植物以及同種植物的不同組織，提取基因組DNA的最適方法也不同[2]。目前，常用的大量提取植物基因組的方法有SDS（十二烷基硫酸鈉）法[3-10]﹑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[11-13]﹑吸附柱法[14]﹑尿素法[15]以及高鹽低pH法[16-18]。

筆者選取去除蛋白和多糖多酚效果較好的3種方法對提取羊草基因組DNA進行比較，包括吸附柱法﹑改良SDS法和改良CTAB法，目的是摸索出一種成本低﹑操作簡單﹑DNA產量高以及純度與完整性都較好的提取羊草基因組的方法，以滿足對羊草進行全基因組測序﹑開發分子標記和親緣關系鑒定等下游試驗的需求。

1?材料與方法

1.1?材料?羊草。

1.2?方法

1.2.1?吸附柱法。

取0.1 g羊草，提取步驟參照植物基因組提取試劑盒（高效植物基因組DNA 提取試劑盒，DP350，天根生化科技有限公司）說明書。因為商品化試劑盒提取的基因組DNA純度較好，因此以吸附柱式的商品化試劑盒提取的羊草基因組DNA為對照，分析其他方法的提取效果。

1.2.2?改良SDS法。

分別取2 g羊草置于液氮中研磨，將羊草葉粉末分別轉移到3個60 ℃預熱的15 mL提取液（50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，臨用前加2%β-巰基乙醇）中，此處用50 mL離心管，65 ℃水浴鍋中溫浴60 min，溫浴完畢后在離心管中加7.5 mL苯酚顛倒混勻，再加7.5 mL氯仿顛倒混勻，4 ℃10 000 r/min（對3批樣品此處分別用3個轉速10 000、8 000和5 000 r/min）離心30 min，吸取上清至新的離心管中。在上清液中加10 μL RNase A（10 mg/mL），常溫放置10 min，用等體積氯仿再抽提1次，吸取上清，加2倍冰預冷的無水乙醇，緩慢顛倒離心管，室溫靜置10 min，用毛細管將基因組DNA挑出來，用70%的乙醇洗滌2～3次，干燥，用500 μL ddH2O溶解DNA。

1.2.3?改良CTAB法。

步驟同改良SDS法，只是提取液不同，CTAB提取液為100 mmol/L pH8.0 Tris-HCl，1.4 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，2%CTAB，1%PVP（MW40 000，W/V，聚乙烯聚吡咯烷酮），臨用前加2%β-巰基乙醇。

1.2.4?電泳。分別取1 μL基因組DNA樣品上樣，加入6×上樣緩沖液，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳15 min，溴化乙錠染色，以 D2000 DNA Marker（MD114）（TIANGEN）為參照，于紫外凝膠成像系統（BioRad，Gel Doc XR+）下觀察并照相。

1.2.5?紫外分光光度計檢測。取1 μL DNA 樣品，用Nanodrop 分光光度計（ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA）檢測DNA的濃度和純度（OD260/OD280 ）。

2?結果與分析

2.1?利用天根植物基因組提取試劑盒提取羊草基因組DNA

由圖1可知，試劑盒提取的3個羊草基因組DNA平行樣的提取結果相對一致，電泳條帶比較平整，沒有拖尾，說明DNA完整性較好，蛋白質和RNA殘留較少，但DNA的量較少。

2.2?利用改良SDS法提取羊草基因組DNA

從圖2可以看出，改良SDS法提取的3個羊草基因組DNA樣品分別是離心轉速為10 000、8 000和5 000 r/min的提取結果，10 000、8 000 r/min提取DNA的電泳條帶拖尾嚴重，說明DNA斷裂嚴重，5 000 r/min提取DNA的電泳條帶有一些拖尾，這是DNA濃度較高導致的。完整性稍好，3個樣品的電泳孔中較亮，說明蛋白質殘留較多，RNA殘留較少，說明該方法去除蛋白質雜質等效果不好，但相對于試劑盒提取效果，改良SDS法提取的DNA量較多。

2.3?利用改良CTAB法提取羊草基因組DNA

從圖3可以看出，改良CTAB法提取的3個羊草基因組DNA樣品分別是離心轉速為10 000、8 000和5 000 r/min的提取結果，其中5 000 r/min的DNA樣品出現彎曲的現象，這是由于DNA濃度較高導致的，其完整性較好，10 000、8 000 r/min的DNA完整性較差，基因組斷裂，說明在大量提取基因組DNA時較高轉速會導致基因組斷裂，應采取低轉速，同時，3個樣品的點樣孔較干凈，沒有蛋白殘留，而且無RNA殘留，說明該方法去除蛋白質雜質等效果好。與試劑盒和改良SDS法提取效果相比，改良CTAB法提取的DNA的量非常多。

2.4?DNA濃度及純度測定——紫外分光光度法

根據紫外分光光度法結果（表1）分析利用這3種提取羊草基因組DNA的方法，3個重復樣本提取效果較為均一，吸附柱法提取DNA的OD260/OD280為1.80～1.93，純度較好但濃度較低，濃度平均值為163 ng/mL，改良SDS法提取DNA的OD260/OD280為1.53～1.79，純度較差，說明蛋白殘留較多，但濃度較高，濃度平均值為1 750 ng/mL，經過改良CTAB 法提取的羊草基因組 DNA 純度和濃度均較好，OD260/OD280為1.89～1.94，尤其是濃度非常高，濃度平均值達3 363 ng/mL。

3?結論與討論

此次試驗所用的3種方法中，吸附法操作簡單，同時吸附柱吸附DNA后不易降解，蛋白質雜質去除效果好，但由于每次上樣量不能超過0.1 g，因此提取量相對較少。與試劑盒相比，利用改良的SDS法和CTAB法對2 g羊草進行大量提取時雖然步驟多，但優點在于完整性較好。提取量明顯提高。同時，離心10 000、8 000 r/min時DNA斷裂嚴重，離心5 000 r/min時基因組斷裂較少，所以在提取羊草基因組時轉速不能過高，避免基因組斷裂，改良SDS法中提取液需要現用現配，而且大量提取時蛋白殘留較嚴重。改良的CTAB法提取液中加入了PVP和β-巰基乙醇，抑制了褐化，而且在大量提取時需要用50 mL離心管，離心轉速選取5 000 r/min時基因組斷裂較少，同時最終用毛細管將基因組DNA挑出來，既提高了DNA的產率又保證了DNA的完整性，同時提高了純度，所以利用該方法提取的DNA純度﹑產率和完整性都較好。綜合考慮，大量提取羊草基因組時利用該試驗中的改良CTAB法最有效。

在此對提取植物DNA提供幾點建議：①材料研磨后要盡快放到提取液中，否則DNA易降解，②加入提取液后60 ℃溫浴時間不要超過60 min，否則容易褐化，③整個操作過程動作要輕柔，否則基因組易斷裂，④在使用酚去除蛋白時，應使用TRIS飽和酚，因為使用水飽和酚時DNA可溶于有機相，不易分離出DNA，⑤離心后取各上層液體時，不應吸取過多，以減少雜質，⑥低溫的無水乙醇在沉淀DNA時效果更好，⑦因為乙醇可抑制酶活性，所以DNA干燥時必須將乙醇晾干，否則會影響后續試驗結果，⑧苯酚有強腐蝕性，乙醇和氯仿易著火、易爆炸、易揮發，能刺激神經系統，試驗過程中

應穿實驗服。

參考文獻

[1] AMANI J，KAZEMI R，ABBASI A R，et al.A simple and rapid leaf genomic DNA extraction method for polymerase chain reaction analysis[J].Iranian journal of biotechnology，2011，9（1）：69-71.

[2] VARMA A，PADH H，SHRIVASTAVA N.Plant genomic DNA isolation：An art or a science[J].Biotechnology journal，2007，2（3）：386-392.

[3] DELLAPORTA S L，WOOD J，HICKS J B.A plant DNA minipreparation：Version Ⅱ[J].Plant molecular biology reporter，1983，1：19-21.

[4] 張英，柏干榮，黃明輝，等.植物基因組DNA提取方法學評析與驗證[J].藥品評價，2004，1（4）：292-297.

[5] SCOTT O R， BENDICH A J. Extraction of DNA from plant tissue [J]. Plant Mol Biol Manual， 1988， A6：1-10.

[6] 王珍，方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種，2003，1（2）：281-288.

[7] 趙懷寶，馮建榮，蔣迪軍，等.葡萄DNA提取與純化方法的比較研究[J].石河子大學學報（自然科學版），2000，4（2）：117-121.

[8] 楊清輝，SMITH R L，謝云蓮.RAPD分子標記在鑒定狼尾草屬雜交后代上的應用[J].西南農業學報，2001，14（1）：4-7.

[9] 袁長春，施蘇華，葉創興.從富含酚類的茶類植物葉中提取純凈的總DNA[J].中山大學學報論叢，2001，21（3）：1-4.

[10] 孫璐宏，魯周民，張麗.植物基因組DNA提取與純化研究進展[J].西北林學院學報，2010，25（6）：102-106.

[11] MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic acids research，1980，8：4321-4325.

[12] CLARKE J D.Cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）DNA miniprep for plant DNA isolation[J].Cold spring harbor protocols，2009，4：5177-5179.

[13] 陳林楊，宋敏舒，查紅光，等.一種改良的植物基因組 DNA通用提取方法[J].植物分類與資源學報，2014，36（3）：375-380.

[14] 王艷，李韶山，劉頌豪.植物總DNA樣品的快速制備[J].激光生物學報，2000，9（1）：79-81.

[15] SUN Y，ZHANG W，LI F L，et al.Identification and genetic mapping of four novel genes that regulate leaf development in Arabidopsis[J].Cell research，2000，10（4）：325-335.

[16] PIERRE G， HAURENCE M D. Isolation of plant DNA： A fast， inexpensive， and reliable method[J].Plant Mol Biol Rep，1992，10：60-65.

[17] 徐虹，鄭敏，章軍，等.三種樟科植物的細胞總DNA提取[J].云南植物研究，2004，26（4）：451-457.

[18] 鄒喻蘋，汪小全，雷一丁，等.幾種瀕危植物及其近緣類群總DNA的提取和鑒定[J].植物學報，1994，36（7）：528-533.