酮康唑抑制氧化亞油酸代謝物介導的外周炎性疼痛機制*

黃文濤，程璐，張耕，胡松

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

組織損傷導致炎癥遞質的釋放，這些炎癥遞質使外周傷害感受器敏感并激活，從而導致對背角神經元的傳入攻擊。瞬時受體電位香草酸亞型-1(transient receptor potential vaniuoed 1，TRPV1)受體是配體門控的陽離子通道，在某些傷害感受器上表達，被有害刺激如熱激活，并介導炎性熱痛覺過敏[1-2]。在組織炎癥過程中，TRPV1活性受多種遞質調節，如花生四烯酸代謝物、緩激肽、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)和前列腺素[3-5]。激活的一類內源性遞質TRPV1由氧化亞油酸代謝產物(oxidized linoleic acid metabolites，OLAM)組成，即9-和13-羥基-10E，12Z-十八二烯酸(9-HODE和13-HODE)及其代謝產物(9-氧自由基和13-氧自由基)。亞油酸為不飽和脂肪酸，在生物體內金屬離子作用下氧化，可以轉變為γ-亞麻酸，并繼而生成為花生四烯酸。研究報道OLAM是，在炎癥條件下合成的，如動脈粥樣硬化和類風濕關節炎[6-8]，慢性胰腺炎患者血清中OLAM含量顯著增加[9]。此外，一些研究小組還檢測OLAM在內皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞[10-11]，以及在組織炎癥過程中激活的細胞類型。然而，研究發現OLAM能夠激活外周組織和脊髓背角的TRPV1[12]。重要的是，由于不知道OLAM在組織炎癥期間是否促進外周TRPV1的激活，所以對這個系統的認識存在差距。酮康唑可通過干擾細胞色素P450酶的活性，抑制真菌細胞膜主要固醇類——麥角固醇的生物合成，造成真菌細胞膜損傷并改變其通透性，造成重要的細胞內物質外漏而殺傷真菌細胞[13]。

1 材料與方法

1.1實驗動物 除了一組野生型和TRPV1基因敲除為C57BL/6小鼠外，其他動物組為雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。實驗動物均購自南方醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2016-0041；實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2016-0167。動物在實驗前至少飼養7 d，每日17:00～18:00喂食，不論前日飼料有無剩余，均加入當日相應量飼料，大鼠自由飲水。每日明暗時間各為12 h，室溫保持在22～25 ℃，相對濕度約50%。

1.2試藥 酮康唑注射液(深圳市思美泉生物科技有限公司，批號：2016-0523，規格：每支15 g)；亞油酸(linoleic acid，LA，深圳市思美泉生物科技有限公司，批號：2016-1185)；抗9-HODE抗體(南京碧云天生物技術有限公司，批號：11252589)；抗13-HODE抗體(南京碧云天生物技術有限公司，批號： 001240762)；弗羅因德佐劑(CFA，北京恒業中遠化工有限公司，批號：2017-08656)。

1.3儀器 貝克曼免疫分析儀(美國貝克曼公司)；501型超級恒溫器(重慶浩為試驗儀器有限公司)；24孔聚D-賴氨酸包被板(南京碧云天生物技術有限公司)；尼康TE 2000 U顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4三叉神經節(trigeminal ganglion，TG)培養 使用培養1 d的大鼠TG。從正常大鼠中分離TG，用聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的玻璃蓋玻片電鍍，置于10%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)和100 ng·mL-1NGF中。將3只大鼠的TGs按文獻[14]所述方法培養，并置于24孔聚D-賴氨酸包被板上，每孔8000個細胞。培養液在24 h后替換，48 h后再次替換。所有實驗均在神經元培養第5天進行。

1.5鈣成像 熒光成像法測量感覺神經元鈣的蓄積。TG培養物與鈣敏感染料Fura-2AM在Hanks改良緩沖液中孵育。用顯微鏡進行熒光檢測。利用MetaFaulor軟件對數據進行收集和分析。鈣離子流入的凈變化通過減去細胞內鈣[Ca2+]i水平計算接觸到激動劑后達到的[Ca2+]i值。細胞用載體或酮康唑(30 μmol·L-1)進行預處理，15 min后再加入LA(1 mmol·L-1)，酮康唑組增加2 min。每個實驗結束時，應用LA后，給予250 mmol·L-1氯化鉀溶液。雙波長激發(340/360 nm)的比值超過0.03被認為是對鈣離子流入的積極反應。

1.6脂質提取物的制備 大鼠注射CFA 20 h后，在頸部注射載體或酮康唑9.5 mg·kg-1，皮下注射。注射藥物4 h后，處死動物，用6 mm穿孔器收集炎癥后足組織。將組織切成小塊，轉入抗山羊IgG抗體(HBSS)中，37 ℃洗滌，平衡30 min。然后將組織轉移到含有載體或酮康唑(150 μmol·L-1)的新鮮HBSS緩沖液中，37 ℃下孵育1 h。在氮氣(N2)環境下，干燥樣品，再懸浮在HBSS中，并應用于培養的感覺神經元，以確定降鈣素與基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)釋放。

1.7CGRP釋放分析和放射免疫測定 用培養5 d的TG在HBSS溶液中進行實驗。在最初的清洗和收集之后，這些神經元在發炎的皮膚上親脂萃取物之前的15 min，給予媒介物或TRPV1拮抗劑(I-RTX)前處理15 min。收集遞質，并在貝克曼免疫分析儀上進行CGRP的放射免疫分析。所有實驗重復3次。

1.8行為測定

1.8.1痛閾值的測定 將抗9-HODE抗體和抗13-HODE抗體各25 μg的混合物50 μL，或熱變性抗體50 μL，注射到發炎24 h的大鼠后足。注射后15， 30，60 min，測量大鼠熱閾值。為了研究酮康唑對CFA熱痛覺過敏的影響，在注射CFA造模前30 s，在同側后足注射酮康唑1次，24 h后注射酮康唑1次。在第2次注射酮康唑后1 h，用熱板法測定痛閾值。

1.8.2非綜合行為時間的測定 ①大鼠注射CFA造炎癥模型前30 s及注射CFA后24 h，對側足內分別注射載體或酮康唑(相同劑量)，1 h后測量熱痛覺過敏。②將LA(10，100或1000 μg)或載體(50 μL)足底注射到正常和炎癥模型大鼠后足中，每2 min記錄一次傷害性反應，直至15 min。③在野生型和TRPV1KO小鼠進行同樣實驗，方法同上。記錄動物非綜合行為時間。

1.8.3傷害性行為時間的測定 大鼠后足注射CFA造炎癥模型，24 h后進行以下實驗。①大鼠后足皮下注射辣椒堿(50 mg·kg-1)或載體，1 h后注射LA 1000 μg。②大鼠足底注射抗9-和抗13-HODE抗體混合物(每種25 μg)或非特異性山羊IgG，，10 min后注射LA 1000 μg。③大鼠在給予LA(1000 μg)前30 min，足底注射酮康唑(4 μg)或載體。記錄大鼠出現傷害性行為的時間。

2 結果

2.2OLAM通過抑制CYP減少炎癥性熱痛覺過敏作用 結果見圖1A和1B。CFA顯著誘導熱痛覺過敏，在24 h效果仍然明顯。注射HODE抗體(圖1A)，在足底注射后30 min，熱痛覺過敏明顯逆轉，熱變性抗體(圖1B)無明顯逆轉。在未發炎足中熱潛伏期接受兩種抗體的混合物 (圖1C)或變性抗體(圖1D)沒有變化。

與媒介物組比較(圖2A和2B)，足底注射酮康唑1 h后，發炎足明顯減少炎性熱痛敏。這種效果是注射酮康唑后的外周調節作用在側后肢，對炎癥足無影響。

2.2酮康唑抑制內源性TRPV1的釋放受體激動劑 培養的TG神經元在使用遞質進行預處理后，隨后進行LA刺激，[Ca2+]i增長3倍，至0.156±0.01。酮康唑預處理后，[Ca2+]i為(0.027±0.01)，消除LA對 [Ca2+]i增強的影響(P<0.005)。

①與空白組比較，P P

①與空白組比較，P

再懸浮的提取物培養TG引起CGRP的釋放增至(980.39±21.04)%，與I-RTX共同處理提取物的CGRP釋放減弱至(200.31±10.01)%，CFA/酮康唑+遞質處理提取物的CGRP釋放減弱至(498.03±13.02%)。

2.3炎癥過程中亞油酸誘發的不良反應具有TRPV1依賴性 與遞質組比較，正常大鼠后足注射LA后，自發性傷害性反應行為的時間增加不顯著。在CFA炎癥模型建立后24 h，足底注射LA產生劑量依賴的傷害性鎮痛效應。見表1。

表1 CFA對TRPV釋放的影響

組別與劑量自發性傷害性反應行為的時間/s正常 遞質組0.39±0.04 LA 1000 μg組3.31±0.01CFA炎癥模型組 遞質組45.03±3.02 LA 10 μg組58.91±5.23 LA 100 μg組78.39±9.04 LA 1000 μg組148.92±13.42F28.459P<0.05

在CFA炎癥模型中，注射LA，非綜合行為時間為(59.39±10.04)s，而使用CPZ預處理，非綜合行為時間為(20.31±8.01)s，可顯著減少被喚起的非綜合行為(t=12.113，P<0.05)。野生型小鼠CFA炎癥模型中，注射LA后，非綜合行為時間為(42.39±8.10)s；而在基因敲除TRPV1小鼠中，僅注射遞質，非綜合行為時間為(5.31±0.41)s，注射LA后，非綜合行為的時間為(20.13±5.72) s，顯著延長(F=51.263，P<0.05)。

2.4抗HODE抗體抑制LA誘導的疼痛 遞質組大鼠傷害性行為時間為(2.11±0.10) s，遞質+LA組為(37.02±4.13) s，抗IgG+LA組為(43.28±5.10) s，抗9-HODE+抗13-HODE +LA組傷害性行為時間下調至(12.03±4.13)s，差異有統計學意義(F=40.902，P<0.05)。

2.5酮康唑抑制LA誘導疼痛 遞質組大鼠傷害性行為時間為(2.45±0.14) s，遞質+LA組為(36.42±6.13) s， 酮康唑+LA組傷害性行為時間下調至(11.28±4.10) s，差異有統計學意義(F=69.132，P<0.05)。

3 討論

酮康唑屬于咪唑類抗真菌藥，對真菌麥角甾醇等固醇的生物合成具有抑制作用；對真菌細胞膜具有損傷，可改變其通透性，引起胞內重要物質漏失；同時也可抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化和過氧化酶的活性，致過氧化物在胞內過度積聚，造成真菌亞細胞結構變性和壞死。亞油酸的氧化代謝物在炎癥條件下升高，如動脈粥樣硬化、類風濕關節炎和慢性胰腺炎[15]。9-HODE、13-HODE及其代謝物是內源性TRPV1激動劑，本研究通過其在炎癥熱痛覺過敏中的作用，擴大對OLAMs的認識。因此，OLAM不僅可以介導感覺神經元對熱刺激的急性反應[16]，而且還可以參與慢性炎癥的發生。由于酮康唑是一種廣泛作用的氧化酶抑制劑，可以抑制發炎皮膚釋放內源性TRPV1激動劑，抑制CFA誘導的熱痛覺過敏，抑制外源性亞油酸對誘發自發性傷害行為的作用。

本研究發現，外源性亞油酸會在注射到發炎部位時觸發自發的行為，但不能控制后爪組織。這種影響與亞油酸呈劑量相關。并且用抗9-HODE和抗13-HODE抗體的預處理可以顯著降低亞油酸的影響，使這些遞質對自發的不良行為產生影響。而這種免疫化實驗并沒有完全阻止亞油酸的綜合效應。這種不完全的敲除可能是由于非HODE OLAMs的形成，例如，9-OXOODE或13-對非OLAM機制，或抗體量不足。事實上，基因芯片研究已經指出在注射CFA后，CYP上調[17]，包括CYP3A1，一種表達在TRPV1+神經元的酶。本研究發現，酮康唑具有抗痛覺過敏作用。酮康唑的這種作用是外周介導的，因為注射到對側后肢沒有效果。這種效應歸因于OLAM的抑制作用。酮康唑阻斷亞油酸誘導培養神經元中[Ca2+]i升高，并顯著降低亞油酸誘導的大鼠行為[18]。

酮康唑抑制內源性TRPV1激動劑從炎癥組織中釋放。然而，由于酮康唑抑制多種氧化酶，包括CYP，其生化作用機制需要進一步研究。因此，酮康唑在損傷部位藥理作用，表明它可能作為新型外周活性鎮痛劑的原型。OLAMs在外周炎性熱痛覺過敏中發揮作用，并且提示氧化酶，如CYP同工酶在OLAM合成中起重要作用。抗OLAM抗體減少CFA誘導的熱痛覺過敏和亞油酸誘發的傷害性鎮痛行為的發現有力地支持OLAM在組織炎癥過程中旁分泌功能，因為抗體不太可能通過血管膜。鑒定表達這些酶的細胞類型和驅動OLAM合成的特異性異構體可為新型鎮痛藥物的開發提供潛在的靶點。

綜上所述，氧化亞油酸代謝物對周圍的炎癥性產生痛覺，而CYP酶在調節OLAM對炎癥性熱痛覺過敏的作用方面起著至關重要的作用。