深圳填海區植物根際土壤耐鹽菌株篩選與鑒定

宋郭柳，王夢華，鄭利錦，袁峰均，史正軍

（1.深圳市萬卉園景觀工程有限公司，廣東 深圳 518042；2.廣州諾晶生物技術有限公司，廣東 廣州 510000；3.深圳市中國科學院仙湖植物園，廣東 深圳 518004）

【研究意義】世界一半以上的人口、生產和消費活動集中在占全球面積不到10%的海岸帶地區［1］，人們對沿海地區土地的需求不斷增大，填海造地成為人們解決“土地赤字”的主要方式［2-3］。然而，由于海岸帶土壤常年受海水侵蝕，其鹽分含量較多，以氯化鈉為主［4］。填海造地意味著海岸帶生態系統自然屬性的永久改變，海水加上周邊高鹽水汽的浸潤使得填海區土壤更易呈現高鹽堿狀態［5］。土壤中過量的鹽分離子對植物生長有抑制作用，一些離子還可對植物產生直接毒害，使植物形態和結構發生變化，細胞膜破壞，營養失衡［6-7］。因此，改造和治理填海區鹽堿土地對改善生態環境，推動區域社會、經濟和生態的可持續發展具有十分重要的意義，而研究耐鹽菌株的分布特征可為下一步鹽漬土改良和降低植物鹽害工作提供有益參考。【前人研究進展】鹽堿地生物改良具有重要的現實意義，其措施主要包括種植耐鹽植物或作物、使用微生物菌肥等方法［8］。劉延吉等［9］從遼寧省寧口沿海產業基地的植物根際鹽堿土中篩選出82株耐鹽細菌，均可在6%鹽濃度的TSB培養基中生長，且對草籽生長有一定的促進作用。周紅姿等［10］從鹽堿地土壤中分離篩選出12株耐鹽細菌，經鑒定分別為假單胞菌屬（Pseudomonas），黃桿菌屬（Flavobacterium），鹽單胞菌屬（Halomonas），微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌（Bacillus），各菌株的耐鹽極限為10%，且對小麥、番茄、辣椒和黃瓜沒有潛在致病性。此外，徐珂等［11］從新疆鹽堿地土壤中分離得到11株耐鹽能力較高的菌株，均為產芽胞，革蘭氏陽性細菌。PCR擴增結果表明，只有5株細菌含有pro耐鹽基因，暗示這些耐鹽細菌具有不同的耐鹽機制。【本研究切入點】耐鹽菌在鹽漬土壤中分布廣泛，研究其分布特征可為填海區高鹽土壤的生物修復和治理提供菌種資源。【擬解決關鍵問題】本研究擬從深圳壩光和寶安填海區灌木根際采集土壤樣品，利用不同濃度的NaCl培養基分離耐鹽菌種，并通過電鏡形態觀察和基因組DNA擴增測序對其進行鑒定，以期為下一步填海區鹽漬土改良和降低植物鹽害工作提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LB培養基（環凱，中國，含1%NaCl）、高鹽LB培養基（在LB培養基中補充添加不同濃度的NaCl）、滅菌鹽水（1% NaCl）、ECO生化鑒定板及緩沖液（Biolog，美國）。

土壤樣品采集：于2019年7月從深圳東部的壩光填海區和深圳西部的寶安填海區多年生灌木根際采集土壤樣品。采用抖落法隨機選取5處灌木采集根際土壤樣品，共10個土樣。采樣時，用干凈小鏟以植株為中心，挖取深約20 cm、長20 cm的帶植株根系的完整土塊，放置在塑料布上，小心敲去根系周圍浮土，抽出根系后再抖動，保留由根系上灑落的土壤，放入無菌密封袋中，每個土樣為5～8株植物根際土壤的混合樣。樣品采集后迅速帶回實驗室，過1 mm尼龍網篩，4℃條件下保存備用。經測定，各采樣點土壤含鹽量分布在4～10 g/kg，土壤pH分布在8.1～9.3。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤懸液的制備 稱取3 g土壤樣品于50 mL滅菌離心管中，添加滅菌鹽水30 mL，置于恒溫搖床上30 ℃振蕩1 h（200 r/min），使土樣均勻分散在滅菌鹽水中成為土壤懸液。

1.2.2 菌株的初級分離 向1.5 mL離心管中依次加入900 μL滅菌鹽水和100 μL土壤懸液，按10倍梯度依次稀釋，再取100 μL稀釋液涂布于LB平板，30 ℃過夜培養。

1.2.3 菌株分離純化及耐鹽性分析 將上述LB平板上生長的菌落進行4次劃線純化，對得到的純化菌株進行耐鹽能力分析。將上述菌株分別接種于不同NaCl濃度（5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）的培養基中。根據初試結果，將具有耐鹽能力的菌株進行耐鹽極限分析，將其接種在鹽含量12%、14%、16%、18%、22%、24%的LB培養基上，30 ℃下培養72 h，觀察其生長情況。

1.2.4 菌株細胞電鏡形態觀察 按照常規透射電鏡負染色制樣方法進行制樣，制樣及觀察過程中的問題處理方式參照劉湘花等［9］的研究；采用FEI-Tecnai 12透射電子顯微鏡（菲利浦，荷蘭）進行觀察并拍照。

1.2.5 耐鹽菌株分子鑒定 使用細菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa，中國）提取耐鹽菌株DNA。細菌16S rDNA基因擴增引物27F/1492R序列以及擴增程序參照Chen等［11］的研究。PCR擴增產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與 GenBank相關數據進行同源性分析，確定耐鹽菌株的分類地位。

1.2.6 菌株碳源利用分析 利用美國BIOLOG公司生產的ECO碳源平板（GENⅢMICROPLATE），對3株不同耐鹽度的代表菌株進行碳源利用情況分析，通過肉眼觀察及分光光度檢測確定各菌株碳源利用情況。

2 結果與分析

2.1 耐鹽菌的分離純化及耐鹽能力分析

從LB培養基平板分離出66株植物根際菌株，在5% NaCl中生長的菌株有55株，在10% NaCl中生長的有14株，編號分別為NY1～NY14。其中，12株能在12% NaCl培養基中生長，11株能在14% NaCl培養基中生長，但當NaCl濃度達到16%及以上時，細菌均不能生長（表1）。

2.2 耐鹽菌株的分子鑒定

利用細菌鑒定通用引物27F和1492R對14株細菌的基因組DNA進行擴增并測序，結果（表2）表明，14株耐鹽菌中有13株來自芽孢桿菌屬，占總耐鹽菌的93%，僅有1株來自溶桿菌屬。13株芽孢桿菌中3株可以鑒定到種水平，另外10株僅能鑒定到屬水平。

2.3 耐鹽菌的電鏡形態特征

對篩選出的耐鹽菌進行電鏡觀察，發現14株耐鹽菌具有不同的形態，其中13株細菌來自芽孢桿菌屬，但是形態差異較明顯。NY1、NY2、NY6、NY7、NY9和NY11呈長條狀，NY3、NY4、NY5、NY8、NY10、NY12、NY13呈現出橢圓狀，且NY3、NY5、NY10、NY13觀察到明顯的鞭毛。電鏡形態掃描和分子鑒定結果表明，鹽漬根際土壤中耐鹽菌具有較高的豐富度和多樣性（圖1）。

2.4 代表菌株碳源利用特征

隨機挑選出NY1、NY2、NY12等3株菌進行ECO碳源利用分析，結果發現，3株菌均能利用的碳源有16種，包括水蘇糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸內酯、D-葡糖酸、葡糖醛酰胺、羥基-苯乙酸、酮酸甲酯、檸檬酸、α-酮-戊二酸、溴-丁二酸、γ-氨基 -丁酸、乙酰乙酸。此外，NY1可以利用6種其他碳源：糊精、D-海藻糖、α-D-乳糖、D-葡糖醛酸、D-乳酸甲酯、吐溫40，總計可以利用22種碳源，占ECO總碳源種類的31%；NY2可以利用13種其他碳源：D-海藻糖、D-松二糖、蜜二糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-果糖、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、粘液酸、奎寧酸、D-乳酸甲酯、D-蘋果酸，總計可以利用29種碳源，占ECO總碳源種類的41%；NY12可以利用16種其他碳源：D-纖維二糖、α-D-乳糖、蜜二糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、粘液酸、奎寧酸、D-蘋果酸、α-羥基-丁酸、β-羥基-D,L -丁酸、α-酮-丁酸、丙酸，總計可以利用32種碳源，占ECO總碳源種類的45%。因此，NY12菌株具有更強的碳源利用能力。

表1 耐鹽菌的NaCl濃度耐受極限Table 1 Tolerance limits of NaCl concentrations of salt-tolerant bacteria

表2 耐鹽菌株鑒定結果Table 2 Identification of salt-tolerant strains

圖1 TEM下耐鹽菌形態Fig.1 Salt-tolerant strains morphology by TEM

3 討論

鹽生植物的根際和根內分布著大量的嗜鹽菌，它們在鹽脅迫下的鹽生植物生長中起著重要作用［12］。本研究從深圳填海區灌木根際土壤中分離出高耐鹽細菌14株，耐鹽度均達到10%以上，多數株能達到14%，這與張廣志等［10］報道的從鹽堿土中分離的芽孢桿菌耐鹽范圍（10%～15%）一致。在分離得到的14株耐鹽菌中，有13株屬于芽孢桿菌，這與多數研究一致［13-14］，表明填海區植物根際土壤具有豐富的芽胞桿菌菌群多樣性。

碳源是微生物生長的必須要素，Biolog ECO板根據微生物對碳源的利用能力差異，用來研究群落中微生物的動態變化［15］。本研究利用Biolog ECO碳源板探究了3株耐鹽菌碳源利用情況，結果發現3株細菌均能利用多種碳源，表明這些菌株可能具有較強的環境適應能力。植物根際微生物能產生植物生長激素、細胞分裂素、乙烯、維生素以及其他植物生長物質，在促進植物生長和改善土壤質量方面起著關鍵作用［16-17］。植物促生菌已被廣泛報道，可以促進植物根系生長、營養元素吸收和光合作用等［18］。常見的根際促生菌包括伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、固氮菌屬（Azotobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、 假單胞菌屬（Pseudomonas）、節桿菌屬（Arthrobacter）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、黃桿菌屬（Flavobacterium）等［19］。Turan 等［20］研究發現，在溫室條件下巨大芽孢桿菌TV-91C、枯草芽孢桿菌TV-17C對甘藍幼苗的生長具有明顯的促進作用，且可以改善其營養成分和激素，這表明芽孢桿菌在植物促生和經濟性狀改良等方面具有開發利用價值。在本研究中，從填海區植物根際土壤共分離得到13株高耐鹽的芽孢桿菌，一方面，芽孢桿菌通過直接合成生長激素等化合物供植物利用；另一方面，通過對病原微生物的生物防治（拮抗作用、信號干擾等），抑制有害根際微生物，從而間接促進植物生長［21］。因此，在今后的研究中，可進一步探索高耐鹽的芽孢桿菌在鹽堿地作物生產上的應用及其潛在機制。

4 結論

在深圳填海區灌木根際土壤中共分離得到14株強耐鹽細菌，為高鹽土壤的生物修復和治理提供了菌種資源。在分離得到的菌株中，13株屬于芽孢桿菌屬，1株屬于溶桿菌屬，其形態和碳源利用能力差異顯著。