卵形鯧鲹JAK3蛋白的原核表達與純化

楊 萌，高爽爽，謝業(yè)揚，段家文，陸專靈，韋友傳

（1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)科學研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021）

【研究意義】Janus激酶（Janus kinase，JAK）為一類與膜受體相關(guān)、存在于胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶，是JAK-STAT（Signal transducers and activators of transcription，STAT）信號傳導通路的重要組成部分。當細胞因子（如IL-2、IL-4和IL-7等）結(jié)合相應(yīng)受體后，JAK負責將細胞因子受體、自身和STAT磷酸化，磷酸化的STAT轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，從而調(diào)控細胞存活、增殖、分化、發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫反應(yīng)等多種生命活動過程［1-3］。在哺乳動物中，JAK家族有4個蛋白成員，分別為JAK1、JAK2、JAK3和TYK2（Tyrosine kinase 2）。其中，JAK3分布于哺乳動物的骨髓和淋巴系統(tǒng)，可以磷酸化STAT1、STAT3和STAT5，將細胞因子信號傳遞并激活下游通路［1,4］。卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）是華南沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和產(chǎn)量上升，養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)，給卵形鯧鲹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。近年來，以疫苗接種作為主要方式的免疫防治被認為是防制魚類病害的安全有效途徑。因此有必要開展卵形鯧鲹的基礎(chǔ)免疫學研究。本研究以免疫通路中重要效應(yīng)分子JAK3為研究對象，開展卵形鯧鲹JAK3（TroJAK3）蛋白表達與純化，為了解TroJAK3蛋白結(jié)構(gòu)、相互作用及抗體制備提供科學依據(jù)。【前人研究進展】哺乳動物JAK3可以介導IL-2、IL-7和IL-15信號傳導，參與調(diào)控巨噬細胞的極化、調(diào)節(jié)細胞發(fā)育和調(diào)節(jié)骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取［6-9］；JAK3可以減少巨噬細胞入侵的數(shù)量，從而減弱腎間質(zhì)纖維化，與腎小管上皮細胞的分化有關(guān)［10］。此外，JAK3基因突變是人類常染色體隱性嚴重聯(lián)合免疫缺陷綜合征的病因，與患者的復發(fā)白血病也有緊密聯(lián)系［11-12］。目前，魚類JAK3的研究非常有限，僅在鯉魚（Cyprinus carpio）［13］、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［14］、復鰕虎魚（Synechogobius hasta）［1］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［15］和 鱖 魚（Siniperca chuatsi）［16］等少數(shù)魚類中有JAK3基因序列及其mRNA表達分析的相關(guān)報道，而有關(guān)魚類JAK3蛋白功能未見報道。【本研究切入點】目前有關(guān)魚類JAK3蛋白的相互作用、蛋白表達及抗體制備等蛋白水平研究匱乏，市面上缺乏魚類JAK3蛋白的商品化抗體，而海水養(yǎng)殖重要經(jīng)濟魚類卵形鯧鲹的JAK3基因序列和蛋白的研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建原核表達載體pET-32a-TroJAK3，表達與純化獲得重組蛋白，為研究TroJAK3蛋白的功能和抗體制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

含有TroJAK3基因的pMD18-T-TroJAK3質(zhì)粒、pET-32a載體、E.ColiTOP10和BL21（DE3）感受態(tài)細胞均由本實驗室保藏。T4 DNA連接酶、DNATaq酶、限制性內(nèi)切酶（HindⅢ和XhoⅠ）和預染蛋白Marker購自TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、脫脂奶粉和West Pico ECL超敏發(fā)光液購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠制備試劑、Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗His單克隆抗體和辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自ImmunoWay（美國）生物技術(shù)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1TroJAK3基因擴增與原核表達載體構(gòu)建 根據(jù)TroJAK3基因序列（GenBank：M N 7 8 2 0 0 2）設(shè)計帶酶切位點引物J A K 3 F:CCAAGCTTACATGGATCTCAGTGAGGAG（HindⅢ）和JAK3 R：CCCTCGAGTGCCTTTAGGGTTCTCTCT（XhoⅠ），以pMD18-T-TroJAK3質(zhì)粒作為模板，PCR擴增程序：94℃預變性4 min；94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 210 s，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說明書進行目的片段純化，用HindⅢ、XhoⅠ對pET-32a和目的片段進行雙酶切，回收酶切片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.ColiTOP10感受態(tài)細胞中，挑選單個菌落進行檢測，引物選用通用引物（T7：TAATACGACTCACTATAGGG和T7 teminal：GCTAGTTATTGCTCAGCGG），PCR擴增程序：95℃預變性5 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃210 s，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)并抽提重組質(zhì)粒，命名為pET-32a-TroJAK3，應(yīng)用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。鑒定成功后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 TroJAK3重組蛋白的誘導表達和可溶性分析 重組質(zhì)粒（pET-32a-TroJAK3）轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑選單克隆接種至含氨芐（100 μg/mL）抗性的5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的菌液按照1∶100接種于含氨芐的20 mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6時（約3 h），取出1 mL作對照樣品，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 37℃誘導4 h。取誘導后菌液1 mL，9 000 g離心3 min去上清，收集菌體作為樣品。其余菌液9 000 g離心3 min去上清，收集菌體后加入PBS重懸，冰上進行超聲破碎，離心收集上清和沉淀進行SDSPAGE和考馬斯亮藍染色檢測表達情況。

1.2.3 誘導TroJAK3重組蛋白純化 將pET-32a-TroJAK3轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日按照1∶100接種于含氨芐的300 mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.6時（約3 h），加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，37℃誘導4 h，4℃ 9 000 g離心3 min收集菌體。按照0.1 g/mL的比例加入pH為8.0細菌裂解液（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L PMSF、1 mg/mL溶菌酶和5 mmol/L EDTA），懸浮菌體，冰浴30 min使其充分混勻后，在冰上進行超聲破碎使細菌裂解。4℃ 9 000 g離心10 min后棄去上清，應(yīng)用洗滌液A（50 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、2%Tween-20和 2 mol/L 尿素）洗滌去除少量脂類、核酸和其他雜蛋白等，渦旋震蕩，4℃ 9 000 g離心10 min，棄去上清；應(yīng)用洗滌液B（50 mmol/L Tris HCl和 500 mmol/L NaCl）洗滌，去除樣品中的EDTA，4℃ 9 000 g離心10 min，棄去上清；加入結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、1 mmol/L β-巰基乙醇和8mol/L尿素）應(yīng)用磁力攪拌器4℃溶解包涵體8 h。將上述樣品4℃ 9 000 g離心10 min，將上清流經(jīng)Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂柱，收集流出液體，并用2 mL結(jié)合緩沖液沖洗。用50、100、150、200 mmol/L咪唑洗脫液各4 mL依次洗脫，分別收集流出液體，通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測分析。

1.2.4 TroJAK3重組蛋白Western blot鑒定 將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)至NC膜，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗His標簽的單克隆抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜。次日，將樣品TBST室溫下洗膜3次（10 min/次），加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶5000）室溫孵育1 h后，再次用TBST洗膜3次（10 min/次），應(yīng)用ECL超敏發(fā)光液顯影并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以PCR擴增TroJAK3，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得3 300 bp的目的條帶，條帶與預期條帶相符。目的條帶與空載體雙酶切（HindⅢ和XhoⅠ）后，得到3 300 bp和5 800 bp條帶（圖1），經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取。測序結(jié)果顯示插入的TroJAK3基因表達框無移碼或突變，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction Identification of prokaryotic expression plasmid

2.2 融合蛋白表達與可溶性分析

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒（pET-32a-TroJAK3）轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細胞，挑取單克隆37℃振蕩培養(yǎng)，加入IPTG使目的蛋白表達。經(jīng)SDSPAGE后，未加入IPTG蛋白有少量表達，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG誘導的重組蛋白高表達，與未誘導的重組蛋白對比發(fā)現(xiàn)在140 ku處有明顯的條帶，與預期目的蛋白的條帶相符。誘導后經(jīng)超聲破碎，將上清和沉淀進行SDS-PAGE，結(jié)果顯示，目的蛋白主要以包涵體的形式表達（圖2）。

圖2 TroJAK3重組蛋白的誘導表達與可溶性分析Fig. 2 Induction expression and dissolubility of TroJAK3 recombinant protein

2.3 目的蛋白純化

目的蛋白在大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞誘導表達后，利用Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂進行過柱，并用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液進行梯度洗脫，將收集的樣品進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，用150 mmol/L咪唑洗脫緩沖液能去掉大量雜蛋白（圖3）。

圖3 TroJAK3重組蛋白的純化Fig. 3 Purification of TroJAK3 recombinant protein

2.4 Western blot鑒定重組蛋白

純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至NC膜，進行Western blot鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，140 ku處有明顯的條帶，與重組蛋白的大小一致，證明重組蛋白成功表達。

圖4 TroJAK3重組蛋白Western blot鑒定Fig. 4 Western blot identification of TroJAK3 recombinant protein

3 討論

JAK3是JAK家族重要成員，可將細胞因子信號從外部環(huán)境轉(zhuǎn)導至細胞核，且在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各種活動中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［1］。免疫系統(tǒng)中細胞因子表面受體因缺乏酪氨酸蛋白激酶活性而聚集，導致細胞不被識別，對細胞發(fā)育及功能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。魚類JAK3的研究主要集中在基因序列和正常組織的表達分析。研究表明，鯉魚［13］、黃顙魚［14］、復鰕虎魚［1］和鱖魚［16］的JAK3基因cDNA全長分別為3 739、3 817、3 524、4 634 bp，推定編碼的氨基酸數(shù)目分別為1 126、1 095、1 103、1 112。正常組織分布分析顯示，鯉魚、黃顙魚、復鰕虎魚和鱖魚JAK3 mRNA分別在頭腎、中腎、脾臟和腮中表達量最高，但并不一致。這種差異可能與品種、年齡、生理及遺傳因素有關(guān)。魚類JAK3分子表達已有所報道，但有關(guān)魚類JAK3蛋白功能與抗體制備的研究鮮有報導，因此對TroJAK3蛋白進行純化，可為了解TroJAK3蛋白功能及抗體制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.1 原核表達載體的選擇

重組蛋白原核表達系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)是大腸桿菌表達系統(tǒng)，原因是其背景清晰、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)條件簡單、價格便宜和操作方便。表達菌株通常采用BL21，可以減少目的蛋白在胞內(nèi)環(huán)境表達的限制，從而使目的蛋白大量表達［19-20］。大腸桿菌表達系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的3種載體為pGE、pQE和pET系列表達載體，其中最高效的表達載體為pET系列［21-22］。研究表明，pET系列載體可以在IPTG誘導下高效表達，并具有產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物易純化等較多優(yōu)點［21,23-24］。本研究選擇pET-32a表達載體，將重組質(zhì)粒pET-32a-JAK3轉(zhuǎn)化至BL21菌株，使目的重組蛋白高效表達，也說明了pET-32a為效率較高的表達載體。

3.2 目的蛋白的存在形式

重組蛋白誘導表達成功后對樣品進行超聲等處理，高速離心后收集樣品進行SDS-PAGE檢測。與上清樣品比較，沉淀樣品在140 ku有明顯條帶，表明重組蛋白表達形式為包涵體。包涵體是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)沉積，重組蛋白大量產(chǎn)生時會形成包涵體，其可以通過簡單的物理方式和增溶的方式將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘男问椒蛛x出來［25］。研究顯示，包涵體蛋白表達具有高表達量和高純度等優(yōu)點，在商業(yè)化生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用［26-28］。本研究TroJAK3重組蛋白以包涵體的形式表達，并獲得了較純的重組蛋白。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建pET-32a-TroJAK3原核表達載體，應(yīng)用終濃度為1 mmol/L IPTG 于37℃誘導4 h，TroJAK3重組蛋白以包涵體形式表達，分子量約為140 ku。通過擴大培養(yǎng)重組菌、菌體破碎、洗滌包涵體、溶解包涵體、流經(jīng)Ni-IDA樹脂柱、梯度濃度咪唑洗脫等步驟，最終純化得到較高純度的TroJAK3重組蛋白。