精子數量對小鼠體外受精與胚胎早期發育的影響

黎桂玲，劉 科，楊 林，黎雄才，鄺少松，王 剛

（廣東省醫學實驗動物中心，廣東 佛山 528248）

【研究意義】隨著生命科學的發展，輔助生殖技術（Assisted Reproductive Technology，ART）［1］和基因編輯技術扮演著越來越重要的角色。小鼠作為人類疾病動物模型，對一些疾病研究具有重要意義，如阿爾茨海默病［2］、帕金森病［3］等。利用小鼠的輔助生殖技術來改善甚至增強小鼠的機能和貢獻力，成為小鼠研究的關鍵環節［4］。【前人研究進展】在輔助生殖技術的研究中，已有對精液保存、卵母細胞體外培養、人工授精、體外受精、胚胎移植和胚胎體外培養等研究［1,4-5］，但在體外受精這一研究中缺乏精子數量對小鼠的體外受精和胚胎早期發育的影響研究。精液分析是評估雄性動物生育能力的最基本檢測項目，精子計數更是其中重要的指標之一［6］。相關研究表明，精液常規分析對預測精子結構和功能完整性的有效性達38.13%［7］。【本研究切入點】關于精液對輔助生殖技術的研究較多，如精液保存的條件及體外受精條件的探討，但從精子數量或密度角度對體外受精及胚胎體外發育的研究較少。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過利用不同精子數量對小鼠體外受精及胚胎早期體外發育影響的研究，進一步完善小鼠體外受精技術，促進輔助生殖技術的發展，從而提高小鼠的繁育工作，為人類疾病動物模型的發展提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗動物：SPF級C57BL/6雌鼠（4周齡，60只）、雄鼠（9周齡，16只），均由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002。

主要儀器：體視顯微鏡（ZSA302T，中國）、倒置顯微鏡（MI 12，中國）、二氧化碳培養箱（熱電3111，美國）、分體式恒溫加熱臺（JR-3020，中國）、血細胞計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司）

主要試劑：注射用血促性素（PMSG）、注射用絨促性素（hCG），均購自寧波第二激素廠；人輸卵管培養液（HTF），配方見表1；M16胚胎培養基、礦物油，均購自Sigma公司。

表1 人輸卵管培養液（HTF）配方Table 1 Formula of human fallopian tube culture fluid（HTF）

1.2 試驗方法

1.2.1 飼養方法 C57BL/6雌雄小鼠均飼養在SPF級屏障設施環境中，溫度控制在20～26℃，相對濕度為40%～70%。光照周期為10 h明/14 h暗，換氣次數大于20次/ h。飲用水均經過高溫滅菌，紫外照射消毒。飼料為廣東省醫學實驗動物中心提供的無菌繁殖鼠料，小鼠自由飲食、飲水。籠具與飼料按2次/周進行更換，均經過嚴格的高溫蒸汽滅菌消毒，進出屏障設施均嚴格遵守相關標準操作規程。動物飼養及試驗均在廣東省醫學實驗動物中心SPF級屏障設施內進行。本試驗經廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查批準（IACUC審查號：B201712-21），嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2.2 超數排卵 隨機選取60只4周齡C57BL/6雌鼠，注射PMSG（10 IU/只），并于46～48 h 后注射hCG（10 IU/只）進行超數排卵，15 h后頸椎脫臼處死，從輸卵管膨大部獲取卵母細胞團放置于提前準備好含HTF的受精皿（含2個160 μL HTF滴和2個50 μL HTF滴，下同）內。

1.2.3 精子計數 隨機選取16只9周齡C57BL/6雄鼠，與欲將淘汰的雌鼠合籠試配3 d，取出雌鼠，單放雄鼠3 d后頸椎脫臼處死后，附睪尾獲取的精子放入提前準備好的含HTF精子皿（含200 μL HTF滴，下同）內，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱中孵育1 h。用移液槍將獲能后的精子從精子滴邊緣分別吸取1、3、5、10、15、20 μL精子溶液滴入血細胞計數板上進行精子計數［8-10］。

1.2.4 體外受精 將60只各裝有兩個卵丘卵母細胞團的受精皿隨機分為6組，每組10個受精皿。從二氧化碳培養箱中取出精子皿，用移液槍從精子滴邊緣分別吸取1、3、5、10、15、20 μL精液置于6個試驗組中，記錄精子計數后，將受精皿置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養24 h。

1.2.5 胚胎的體外培養和胚胎收集 精卵共孵育24 h后，從培養箱取出受精皿，撿出未受精的卵母細胞、1-細胞合子、2-細胞胚胎及畸形胚胎，放于受精滴旁邊的50 μL HTF滴中洗凈后，置于提前準備并已孵育2 h的M16培養滴中。準確計數卵母細胞、1-細胞合子、2-細胞胚胎及畸形胚胎，并計算受精率、2-細胞胚胎發育率和畸形率。

1.3 數據統計分析

利用SPSS 21.0軟件進行數據處理及差異顯著性分析，組間差異用Duncan's多重范圍檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同精子數量對體外受精率的影響

從不同精子溶液體積的精子數量（表2）可以看出，在精子外環境相同的情況下，不同精子溶液體積的精子數量不同。通過同批次超排后取得的卵母細胞團中加入不同精子數量的精子溶液后發現，其體外受精率隨精子數量的增加而出現一定的降低趨勢，且差異較大。進一步比較發現，精子數量為1.23（±0.31）×106個/mL和2.03（±0.35）×106個/mL的體外受精率較高，分別為95.17%、94.29%，但差異不顯著，與精子數量 為 0.25（±0.23）×106、3.95（±0.33）×106個/mL的體外受精率差異顯著，而極顯著高于精子數量 為 6.50（±0.76）×106、9.88（±0.52）×106個/mL的體外受精率。

表2 不同精子數量與體外受精率的影響Table 2 Numbers of sperm and in vitro fertilization rates with different sperm solution volumes

2.2 不同精子數量對胚胎生長發育的影響

小鼠體外受精過程中，不同精子數量不僅使體外受精率有較大差異，也會使胚胎的發育受到一定影響。體外受精24 h后，正常2-細胞胚胎隨精子數量的不同存在一定差異（圖1A）。進一步比較發現，精子數量為1.23（±0.31）×106、2.03（±0.35）×106個/mL時，2-細胞胚胎發育率較好，均顯著高于精子數量為（6.50±0.76）×106個/mL的情況，均極顯著高于精子數量為9.88（±0.52）×106個/mL的情況。同時，精子數量數 為 3.95（±0.33）×106、6.50（±0.76）×106個/mL的2-細胞胚胎發育率均極顯著高于精子計數為9.88（±0.52）×106個/mL的情況。

在胚胎體外發育過程中，不同精子數量導致胚胎異常發育的差異較大（圖1B）。通過比較發現，精子數量為9.88（±0.52）×106個/mL時，胚胎異常發育的概率較大，與精子數量分別為0.25（±0.23）×106、1.23（±0.31）×106、2.03（±0.35）×106、3.95（±0.33）×106、6.50（±0.76）×106個/mL的情況相比，差異均極顯著。

圖1 不同精子數量對胚胎生長發育的影響Fig. 1 Effects of different sperm counts on the growth and development of embryos

3 討論

血細胞計數板是最早應用于精子計數的計數池之一，也是目前WHO推薦使用的精子計數工具，目前仍被廣泛應用［9］。雖然血細胞計數板的計數池深度為0.1 mm，精子容易互相重疊，但使用血細胞計數板時，精液標本需要稀釋，因此，血細胞計數板的結果更接近于真實值。Johnson等［10］認為血細胞計數板可作為精液常規分析的“金標準引”。因此，本研究在對小鼠精液的常規分析中利用血細胞計數板進行精子計數是常見且較為準確的方法。本試驗中精液獲能1 h后，活力較好的精子會逐漸向精子滴四周邊緣游去，精子滴中間留下的精子活力較差或是死精。隨著精子溶液體積的增加精子數量也不斷增加，且具有一定的差異性。

ART是利用人工的方法使精子和卵子相互結合的技術，包括精液保存、卵母細胞的體外培養、人工授精、體外受精、胚胎移植和胚胎體外培養等技術［11-12］。ART的不斷完善在一定程度上對動物及人類生殖過程、遺傳病機制、干細胞定向分化［13］等研究課題提供了基礎；同時，ART的臨床應用為這些課題的深入研究積累經驗，創造發展條件，推動醫學及生命科學的不斷發展進步［14］。體外受精技術是ART重要的組成部分，將從母體取出的卵細胞置于培養皿內，加入經優選誘導獲能處理的精子，使精卵合適的條件下進行體外受精，獲取一定數量優質胚胎的技術。在相關小鼠體外受精技術研究中，遺傳背景［15-16］、品系［17-19］、培養液成分［20-21］、精子與卵母細胞質量等相關研究都較為成熟，但對精子計數的研究較少。通過對不同精子計數進行體外受精實驗可以發現精子數量為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個/mL時，小鼠的體外受精率較高，隨著精子數量的增加，體外受精率呈現一定的下降趨勢，這一結論與Fraser等［22］的研究結果相似。在本試驗中小鼠的體外受精率隨精子數量的增加而降低，該趨勢的出現與營養物質和共存環境有關。在一定范圍內，HTF培養液中的營養可以促使精子與卵母細胞發生受精作用形成受精卵，進一步發育成胚胎。隨著精子數量的增加，精子間的“競爭”與精子與卵母細胞的“競爭”都會導致其活力的下降，從而使受精率降低；同時，過多的精子與卵母細胞的代謝產物在一定程度上也會導致受精率降低，進而導致胚胎的正常發育。

正常情況下，有些精子5 min內就能到達輸卵管壺腹部［23］，但并不具備受精能力，需要在輸卵管內進行獲能。HTF液為輸卵管培養液，在37℃、5%CO2、飽和水分的環境下，所處環境和理化因子與雌鼠輸卵管內環境相似。精子首先穿過卵丘團和透明帶，發生頂體反應后方可與卵母細胞膜融合完成受精。體外受精后胚胎在11～18 h完成DNA復制，17～20 h后進行卵裂［24］，在受精24～27 h后胚胎能正常發育到2-細胞中期［25］。因此，精子需在HTF液中培養1 h獲能后方可進行體外受精試驗，體外培養24 h后可正常發育到2-細胞。

相關研究表明，胚胎的發育不僅與排卵率、生存空間、胎兒先天性缺陷、生殖激素、子宮感染及營養水平等有關，同時還受品種、遺傳、胎次和環境條件的影響［26］。37℃、5% CO2、飽和水分的環境下發現，不同數量的精子參與體外受精，在經過24 h后胚胎發育正常至2-細胞胚胎的概率有較大差異。精子數量為0.25（±0.32）×106～3.95（±0.33）×106個/mL時，正常發育到2-細胞胚胎的概率差異不顯著，但精子計數為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個/mL時胚胎受精率及2-細胞胚胎發育率較好；隨著精子數量增加到6.50（±0.76）×106個/mL時，2-細胞胚胎率顯著性降低；精子計數增加到9.88（±0.52）×106個/mL時，胚胎正常發育情況較差，且畸形胚胎較多。該現象表明未受精的精子在一定程度上成為了胚胎發育的“競爭者”，不僅與胚胎爭奪營養物質與生存環境，其代謝產物也會影響胚胎的正常發育，進一步說明胚胎的發育與所處的營養環境密不可分。不利的胚胎營養環境可以阻礙胚胎發育，影響胚胎代謝，導致胚胎發生慢性疾病甚至停止發育，甚至會增加動物出生后代謝性疾病的發生率［27］。由此看來，精子數量不僅對小鼠體外受精率有影響，而且也會影響小鼠胚胎的正常發育。

4 結論

本試驗通過血細胞計數板對小鼠精子進行計數，利用不同精子數量參與小鼠體外受精并進行體外培養，對體外受精率和正常發育到2-細胞胚胎的概率比較分析得出，精子數量為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個/mL時，小鼠的體外受精和胚胎體外培養發育較好，從而獲得較多優質的胚胎。本試驗結果豐富了體外受精技術，促使小鼠的輔助生殖技術得到進一步完善，同時對小鼠的輔助生殖技術、基因工程等研究提供了一定的參考。