正交試驗優(yōu)化黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取工藝研究

吳 鵬，史 銳，鄒長鑫，劉苗苗

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又稱野櫻莓、不老莓，屬于薔薇科腺肋花楸屬植物，果實為紫黑色圓形小漿果，富含蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、微量元素、多酚類化合物等，其中黃酮，花青素、原花青素和酚酸等多酚類物質(zhì)發(fā)揮著最主要的生理活性[1]，具有極強的清除自由基的能力，此外還可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，有效預(yù)防和治療糖尿病、動脈粥樣硬化等[2-3]。

綠原酸屬于酚類化合物，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽等多種藥理作用[4]，被稱為第七大營養(yǎng)素[5]。因綠原酸所具有的獨特生物活性，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6-7]。但國內(nèi)對黑果腺肋花楸中綠原酸含量的相關(guān)研究較少，且關(guān)于其含量測定方法的介紹并不詳細。本實驗采用超聲法提取黑果腺肋花楸果實中的綠原酸，并在料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化其提取工藝，為黑果腺肋花楸果實的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果實(遼寧華嵿農(nóng)業(yè)科技有限公司)；綠原酸標準品(北京索萊寶試劑有限公司)；甲醇、無水乙醇、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

UV5100紫外可見-分光光度計；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器；精密分析天平；FW100高速萬能粉碎機；電熱恒溫鼓風干燥箱。

2 實驗方法

2.1 原料前處理

于-80 ℃冰箱中取出黑果腺肋花楸果實，蒸餾水解凍過夜，45 ℃烘干，打粉過五號篩備用。

2.2 黑果腺肋花楸果實中綠原酸樣品制備

精密稱取黑果腺肋花楸果實粗粉1 g，精密加入25 mL 60%乙醇-鹽酸溶液，稱重，45 ℃條件下超聲提取60 min，放冷，加相應(yīng)溶劑補足重量，搖勻抽濾，得待測樣品粗提液。

2.3 黑果腺肋花楸果實中綠原酸含量測定

2.3.1 波長掃描 精密吸取一定量待測樣品提取液，采用紫外分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，確定綠原酸的最大吸收波長為297 nm。

2.3.2 綠原酸標準曲線繪制精密稱取綠原酸標準品0.003 g，采用甲醇-鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶中，分別精密吸取0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL母液定容至10 mL容量瓶。在波長297 nm處測定不同濃度標準品的吸光度(A)值，以綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.3 綠原酸含量測定 移液槍吸取一定量待測液，用對應(yīng)溶劑定容至10 mL容量瓶，在297 nm處測定待測液吸光度，根據(jù)回歸方程求出提取液中的綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.3.4 綠原酸提取率計算

綠原酸提取率=(V·C·D×10-6)/M×100%

(1)

式中V：提取液定容體積，mL；C：標曲求得綠原酸濃度，μg/mL；D：提取液稀釋倍數(shù)；M：黑果腺肋花楸果實樣品質(zhì)量，g。

2.4 黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的單因素考察

精密稱取1.0 g黑果腺肋花楸果實粉末，對提取溶劑、乙醇分數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比進行考察，按照“2.3.3”“2.3.4”項下方法計算綠原酸含量及提取率，確定最佳提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 綠原酸標準曲線建立

線性回歸方程為y=0.08x-0.011(r=0.999 6)，其中x為綠原酸質(zhì)量濃度，y為吸光度值，由圖1可知綠原酸在1.8～12.6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖1綠原酸標準曲線

3.2 單因素對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的影響

3.2.1 溶劑對綠原酸提取率的影響圖2顯示，與水提法相比，乙醇提取法對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率影響顯著，綠原酸提取率從0.448%提高到0.592%。這是由于綠原酸在酸性介質(zhì)中表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，然而酸性過高會導(dǎo)致其他雜質(zhì)有機鹽被酸化溶出，故本實驗在2種溶劑中分別加入0.2 mol/L鹽酸溶液。此外，初期對不同體積分數(shù)的乙醇溶劑進行比較，發(fā)現(xiàn)不同體積分數(shù)的乙醇對綠原酸提取率較大影響。因此需要進一步對不同乙醇體積分數(shù)進行考察。

圖2不同提取溶劑對綠原酸得率的影響

3.2.2 乙醇體積分數(shù)對綠原酸提取率的影響 圖3顯示，乙醇體積分數(shù)越高，綠原酸提取率越高，在乙醇體積分數(shù)為60%時，綠原酸提取率達到最大，為0.938%，而后出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這是由于綠原酸的極性偏大，高濃度的乙醇不易使其溶解，致使過多脂溶性雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

圖3乙醇體積分數(shù)對綠原酸提取率的影響

3.2.3 料液比對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的影響 圖4顯示，隨著料液比的增加，綠原酸提取率逐漸從0.837%提高至0.908%，在1∶45(g/mL)達到最大，而后隨著料液比的增加，綠原酸提取率下降至0.769%。這是由于在一定范圍內(nèi)溶劑越多，樣品與原料接觸更充分，傳質(zhì)作用越強，綠原酸提取率增大，但溶劑過多會致使醇溶性蛋白等雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

3.2.4 提取溫度對綠原酸提取率的影響圖5顯示，隨著溫度的升高，綠原酸提取率逐漸升高，在55 ℃時達到最大，為1.064%。當溫度達到60 ℃時，綠原酸提取率有所下降。因這是由于溫度升高會發(fā)生分子的熱運動現(xiàn)象，分子的動能增加，可促進分子運動與物質(zhì)交換。但溫度過高會致使綠原酸部分分解，影響綠原酸提取率。

圖4料液比對綠原酸提取率的影響

圖5提取溫度對綠原酸提取率的影響

3.2.5 提取時間對綠原酸提取率的影響圖6顯示，隨著提取時間的延長，黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率從0.890%逐漸提高到0.981%，但提取時間達到75 min后，提取率有所下降。這是由于超聲時間短，綠原酸未完全溶出，而超聲時間過長，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，可吸附些許綠原酸，此外還可能發(fā)生熱效應(yīng)，致使部分綠原酸分解，影響提取率。

圖6提取時間對綠原酸提取率的影響

3.3 黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取工藝條件的優(yōu)化

3.3.1 提取各因素水平的建立 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定乙醇濃度、溫度、料液比及超聲時間為主要的影響因素，每個因素設(shè)置3個水平。以黑果腺肋花楸綠原酸提取率為指標，采用L9(34)正交試驗篩選最佳的提取工藝，設(shè)計的正交試驗各因素水平范圍見表1。

表1 正交試驗各因素水平設(shè)計

3.3.2 正交試驗結(jié)果與分析 按照上述設(shè)計的因素水平依次進行測定，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

正交試驗結(jié)果表中R值顯示，影響黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的因素順序為乙醇分數(shù)>提取溫度>提取時間>料液比。K值顯示，提取最優(yōu)組合為A2B1C1D2，即乙醇分數(shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時間60 min。進行3次驗證性實驗，測得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，RSD為0.07%，與正交表內(nèi)結(jié)果相比，可確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

4 結(jié)論

本實驗確定的黑果腺肋花楸果實中綠原酸的最佳提取工藝為乙醇分數(shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時間60 min，在此提取工藝下進行3次驗證性實驗，測得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，相較王鵬等[8]報道的綠原酸含量有明顯升高。本研究結(jié)果表明，以60%乙醇加酸性介質(zhì)為溶劑，運用超聲法提取能有效提高黑果腺肋花楸果實中綠原酸的提取率，為黑果腺肋花楸的進一步研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。