“遠志-石菖蒲”藥對治療阿爾茨海默病的作用機制研究

羅 虹，劉凱麗，王 艷

(山西中醫藥大學，山西 晉中 030619)

藥對是臨床常用的兩味藥物的配對形式，能起到協同作用，或增強藥性，或相互制約、緩解毒性[1]。遠志與石菖蒲伍用，名曰遠志湯，出自《圣濟總錄》，可治久心痛。遠志芳香清冽、辛溫行散、寧心安神、散郁化痰；石菖蒲辛散溫通、利氣通竅、辟濁化濕、理氣化痰、活血止痛。遠志通于腎、交于心，石菖蒲開竅啟閉寧神。二藥伍用，可通心竅、交心腎、益腎健腦聰智，開竅啟閉寧神之力增強[2]。

遠志為遠志科植物遠志(polygalatenuifoliawilld.)或卵葉遠志(polygalasibiricaL.)的干燥根，主要含有三萜皂苷、糖酯類化合物以及香豆素、木質素、黃酮、生物堿等成分[3]。遠志味苦、辛，性微溫，歸心、腎、肺經，具有寧心安神、祛痰開竅、消散癰腫的功效，主治驚悸、失眠健忘、癲癇發狂、咳嗽痰多、癰疽瘡毒、乳房腫痛等[4]。《名醫別錄》中云遠志：“定心氣，止驚悸，益精，去心下膈氣，皮膚中熱，面目黃。”其臨床功效主要為“寧心安神、祛痰開竅、消散癰腫”[4]。

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖，含揮發油0.11%～0.42%，包括為β-細辛醚、α-細辛醚、石竹烯、α-葎草烯、石菖醚、細辛醚等，尚含有氨基酸、有機酸和糖類等其他成分[5-6]。石菖蒲性溫，味辛、苦，歸心、胃經，具有開竅醒神、化濕開胃、寧心安神的功效，主治脘痞不饑、噤口下痢、神魂癲癇、健忘耳聾[5-6]。《藥性論》云：“治風濕頑痹，耳鳴，頭風，淚下，殺諸蟲，治惡瘡疥瘙。”《神農本草經》云：“主風寒濕痹，咳逆上氣，開心孔，補五臟，通九竅，明耳目，出音聲。”

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種漸進性的中樞神經系統的退行性變性病，主要表現為認知功能障礙、日常生活能力下降和精神行為異常[7]。中醫學文獻中沒有阿爾茨海默病這一病名，相關臨床表現的大量論述散見于癡呆、呆病、善忘、文癡、神呆、郁證等疾病的論述中[8]。皇甫謐在《針灸甲乙經》中以“呆癡”命名，虞摶《醫學正傳》謂之“愚癡”，《資生經》名曰“癡證”，癡呆病名首見于漢代《華佗神醫外傳》，楊繼洲的《針灸大成》則分別以“呆癡”和“癡呆”命名，明代《景岳全書·雜證謨》第一次提出“癡呆”是獨立性疾病[9]。

本研究利用網絡藥理學方法研究遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病的相關機制。網絡藥理學從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統性出發，采用復雜網絡模型表達和分析研究對象的藥理學性質，適用于闡釋中藥多成分-多靶點的作用關系[10]。

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件

TCMSP V2.3.0數據庫、PubChem數據庫、SWISS數據庫、TTD數據庫、Uniprot Database數據庫、DAVID V6.8.0數據庫、Cytoscape V3.7.0軟件及其Bisogenet插件、CytoNCA插件、ClueGO插件。

1.2 遠志與石菖蒲中有效成分篩選

通過TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)數據庫查找相關文獻，獲取中藥化學成分相關信息，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18[11]作為條件，篩選遠志與石菖蒲中的有效成分。OB為口服藥物吸收至體循環的速度與程度，反映了藥物生物活性分子類藥性的優劣[12]。

1.3 藥物有效成分靶點網絡構建

將上述步驟篩選出的有效成分名稱輸入PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，獲取每一成分的SMILES結構式及2D結構或3D結構，輸入SWISS數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得藥物成分靶點，根據probability≥0.7[13]標準進行進一步篩選。

利用Cytoscape3.7.1軟件，將篩選后的遠志與石菖蒲的主要活性成分名稱及其對應靶點數據導入，生成成分靶點可視化網絡。通過String數據庫選擇需要的蛋白質相互作用，構建遠志、石菖蒲藥物有效成分靶點PPI網絡。

1.4 阿爾茲海默病相關靶點網絡構建

在TTD數據庫(https://db.idrblab.org/ttd/)中Search drugs and targets by desease or ICD identifier一欄輸入疾病的英文名稱(Alzheimer disease)獲得疾病一級靶點。在TCMSP數據庫中選擇Disease name一欄，輸入Alzheimer disease，搜索疾病相關靶點，兩種方法得到的靶點取交集確定為疾病相關的靶點[14]。使用Uniprot Database數據庫(https://www.uniprot.org/)選擇物種為“human”的靶點，將蛋白名稱和基因名稱進行轉換。

利用Cytoscape軟件將疾病靶點數據導入Cytoscape得到疾病靶點可視化網絡。通過String數據庫，輸入基因列表，構建疾病靶點PPI網絡。原則：物種智人(Homo Sapiens)。

1.5 交集網絡構建及生物通路分析

先利用Bisogenet插件分別構建藥物成分靶點PPI網絡和疾病靶點PPI網絡，再采用Cytoscape中的merge工具得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網絡，并用Cytoscape中的CytoNCA插件對該網絡中每個節點的拓撲參數進行評估分析，選擇degree值≥2倍中位數的靶點作為核心靶點，得到一個更細致的交集網絡。使用DAVIAD數據庫對核心靶點進行富集分析，選擇GO分析和KEGG分析，得到富集分析通路，進行進一步討論。

2 結果

2.1 遠志及石菖蒲有效成分篩選

按照上述篩選條件得到石菖蒲活性成分4個，從文獻中篩選出石菖蒲活性成分2個，共計6個，分別為木脂素類、黃酮醇類、揮發油等成分。遠志活性成分6個[15-16]，為皂苷類、甾醇類等成分。兩藥共篩選得到12個活性成分(如表1)，獲取180個靶點蛋白，根據probability≥0.7[13]篩選得到靶點共44個。

表1 遠志-石菖蒲藥對中的12個活性成分

2.2 遠志-石菖蒲有效成分靶點PPI網絡

將篩選出的12個活性成分及其對應靶點相連構建成分靶點PPI網絡，見圖1。40個靶點中，除2個靶點沒有產生交互關系，其余38個節點均有交互關系，產生68條邊，degree(節點通過邊的個數)平均值為3.58，平均聚類系數為0.441，P-value<0.01。

圖1成分靶點PPI網絡

2.3 阿爾茲海默病靶點PPI網絡

在 TTD數據庫中與阿爾茨海默病有關的一級靶點共95個，在TCMSP數據庫中與阿爾茨海默病相關的靶點有30個，對兩種方法得到的靶點取交集，共得到14個阿爾茨海默病一級靶點，見表2。構建疾病靶點PPI網絡如圖2所示，14個靶點中有1個沒有參與蛋白相互作用，13個靶點有蛋白相互作用。網絡圖包括13個節點，31條邊，節點度degree平均值為4.43，平均聚類系數為0.492，P-value<0.01。

表2 阿爾茨海默病靶點

圖2疾病靶點PPI網絡

2.4 遠志-石菖蒲有效成分靶點與阿爾茨海默病靶點交集網絡

采用Cytoscape中的merge工具得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網絡，共287個節點。根據數據顯示該交集網絡的degree中位值為11，設定篩選范圍為degree值≥22，共76個節點，構建PPI網絡，見圖3。其中有兩個靶點沒有產生互交，74個靶點產生363條互交關系，節點度degree的平均值為9.55，平均聚類系數為0.553，P-value<0.01。

2.5 生物通路分析結果

將交集網絡核心靶點的基因鍵入DAVID數據庫中進行KEGG分析和GO分析。KEGG分析共導出通路74條，GO分析共導出263條，選擇P<0.01[11]的通路，再按照相關性排序，結合文獻篩選得到KEGG通路5條(見表3)，GO通路2條(表4)。KEGG分析結果顯示，PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、雌激素信號通路可能是遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病的相關信號通路。GO分析結果顯示，beta-catenin-TCF復合物組裝、MAPK級聯(MARK cascade)等通路與遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病有關。

圖3成分靶點與疾病靶點交集PPI網絡

表3 KEGG分析結果

表4 GO分析結果

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法，構建遠志-石菖蒲成分靶點及阿爾茨海默病相關靶點網絡，對分子水平上揭示遠志-石菖蒲治療阿爾茨海默病的機制進行探索。通過藥物化學成分分析，得到遠志-石菖蒲藥對主要有效成分12個。藥物有效成分靶點與疾病靶點交集圖印證了遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茨海默病涉及多個活性成分、靶標以及通路。生物通路分析結果顯示，遠志-石菖蒲藥對治療阿爾茲海默病的機制與調節PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、雌激素信號通路等有關。

PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶)信號通路是維持細胞正常生理功能的重要信號轉導途徑，可以調節細胞分裂、分化、遷移、骨架重排等生理過程，同時具有肯定的抗凋亡效應[17]。 PI3K-Akt信號通路與阿爾茨海默病的發生與發展具有一定的聯系，通過改變PI3K-Akt信號通路表達可以實現對阿爾茨海默病發病機制的調節[18]。PI3K被細胞外信號活化后，可激活下游蛋白激酶Akt。在阿爾茨海默病的發病過程中，凋亡相關基因Bad、GSK-3、轉錄因子家族、caspases家族等參與了神經元的凋亡，導致神經元的大量丟失，而活化的Akt通過磷酸化Bad、GSK-3、轉錄因子家族、IB、caspases等使促凋亡基因失活，從而起到抑制神經元凋亡及促進神經元存活的作用，進而減少阿爾茨海默病神經元的大量丟失，改善阿爾茨海默病的病理變化[19]。激活PI3K-Akt信號通路可促進Bcl-2表達，緩解HIBI引起的神經元凋亡，從而發揮腦保護作用[20-21]。

ErbB信號不足與神經退行性疾病的進展有關，如阿爾茨海默病[22]。有證據表明，NRG/ERbB信號在大腦中存在一個最優水平，偏離這一水平會損害大腦功能[23]。阿爾茨海默病中的突觸丟失、膠質增生、炎癥和神經元死亡等病理變化與神經調節蛋白-1(NRG-1)及其受體erbB2、erbB3和erbB4的表達改變有關[24]。

在雌激素信號通路中，雌激素激活雌激素受體ER和GPR30。阿爾茨海默癥患者中有2/3為女性，該病女性患病率高與絕經期間卵巢性激素的喪失有關[25]。阿爾茨海默患者大腦白質中雌激素受體β顯著減少[26]，雌激素受體β的作用之一在于降低阿爾茨海默病大鼠海馬體中的炎癥反應水平和β淀粉樣蛋白沉積程度，并提高學習和記憶能力[27]。

MAPK信號通路是細胞內的一條蛋白質鏈，其將細胞表面受體的信號傳遞給細胞核內的DNA，非正常MAPK級聯的功能與癌癥、糖尿病、自身免疫性疾病和發育異常等疾病的誘導和發展有關[28]。

4 結論

網絡藥理學分析結果表明，遠志-石菖蒲藥對中的有效成分治療阿爾茨海默病可能通過PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、雌激素信號通路等發揮作用。本研究為該藥對健腦作用的相關機制提出了預測，為其進一步研究奠定了基礎。