HPLC法測定烏發生發液中二苯乙烯苷含量

黃 丹，劉恒言，凌成利，向 韻，梁詩意，向愛香，雷 昌*

(1.湖南中醫藥大學/湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙 410208；2.湘西自治州民族中醫院，湖南 吉首 416000)

脂溢性脫發(seobrrheic alopecia，SA)簡稱脂脫，又名男性型禿發、雄激素源性禿發，中醫稱之為“發蛀脫發”“蛀發癬”，臨床多表現為頭發油膩、多屑，有明顯瘙癢感，額顳區及頂部的漸進性脫發，繼而形成高額[1-2]。此病是皮膚科的常見病、多發病，也是難治性疾病之一。由于本病影響美觀，常給患者帶來很大的精神壓力和心理負擔[3]。

不同于醫院的專業治療，更多的SA患者傾向于生活中日常防護，洗發水作為和頭發接觸最多的日常用品，在解決毛發問題上有著一定便利性[4-5]。近年來，中藥在洗發水中廣泛應用，技術發展很快，起到了治療SA的效果，受到廣大消費者的熱愛，該類型的中藥洗發水也成為各機構研究的熱點之一[6-7]。烏發生發液來源于老中醫臨床經驗方，由制何首烏、側柏葉、白鮮皮、路路通、墨旱蓮等12味中藥組成，方中用制何首烏、女貞子、墨旱蓮滋陰補腎生發，側柏葉生發烏發，當歸、桃仁、紅花活血化瘀，生地黃、熟地黃滋陰補血，白鮮皮清化濕熱，路路通、刺蒺藜祛風除濕。全方共奏補腎生發、滋陰補血、活血化瘀、清熱利濕、祛風除濕之功。該洗發液已于臨床運用10余年，能有效治療SA患者的脂溢性皮炎及瘙癢感，緩解SA患者的脫發癥狀，該產品已證明安全無不良反應。本研究以烏發生發液中君藥何首烏的主要有效成分二苯乙烯苷為檢測指標，采用高效液相色譜法測定其含量，為該制劑質量標準的建立提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aigent-1260高效液相色譜儀(安捷倫儀器設備有限公司)，電子天平(AL204，梅特勒-托利多上海有限公司)，旋轉蒸發儀(Heidolph Hei-VAP，上海本昂科技儀器有限公司)，水循環真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州紫拓儀器有限公司)，恒溫循環鼓風干燥箱(WGL-230B，天津市泰斯特儀器有限公司)，KM-250DE超聲波清洗器(昆山美超聲儀器有限公司)，純水儀(ELGA，UK)。

1.2 材料

二苯乙烯苷對照品(批號：J1708Z45941，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇為色譜純，實驗用水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性

色譜柱采用依利特Supersil ODS-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測波長為320 nm，進樣量10 μL，理論板數按二苯乙烯苷峰計算應不低于2 000。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取二苯乙烯苷對照品4.1mg，置25mL量瓶中，加稀乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1mL中含二苯乙烯苷0.164mg的對照品溶液。

2.3 烏發生發液的制備

按照處方取何首烏、當歸、側柏葉、黑芝麻、黑豆等18味中藥材，置于電熱爐中，提取2次。第1次加10倍量水，浸泡30 min后，通電加熱，自沸騰開始計時，提取2 h。第2次加10倍量水，通電加熱，自沸騰開始計時，提取2 h，合并兩次提取液(過200目篩)，冷卻，50 ℃真空減壓濃縮至200 mL，測定pH和密度，放入冰柜(-40 ℃)冷凍過夜，然后冷凍干燥，即得烏發生發液干燥粉末。

2.4 供試品溶液的制備

取烏發生發液干燥粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇25 mL，再稱重，超聲30 min，取出放冷，補重，搖勻，過0.45 μm微孔薄膜，注入棕色樣品瓶中，即得。

2.5 陰性對照溶液的制備

按照配方，取除何首烏外的17種藥材(當歸、女貞子、黑芝麻等)，按照“2.3項下烏發生發液”方法，制成缺何首烏藥材的烏發生發液，再按照“2.4項下供試品溶液制備”方法，制成缺何首烏的陰性對照溶液。

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線的制備將二苯乙烯苷對照品溶液用稀乙醇分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，按照“2.1”項下色譜條件測定，設置進樣量為10 μL，并以各自標準品的濃度為橫坐標(X)，波長320nm下的峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。最終得二苯乙烯苷的線性回歸方程為：Y=968.04X+15.793(r2=0.999 2)，線性范圍為：3.29～16.4 μg。

2.6.2 穩定性試驗取制備好的供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h定時進樣，每次進樣10 μL，測定并計算得二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.68%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.6.3 精密度試驗連續進樣供試品溶液6次，每次10 μL，測定并計算得二苯乙烯苷峰面積RSD為0.90%。表明儀器精密度符合要求。

2.6.4 重復性試驗取制備好的供試品溶液6份，依次進樣，進樣量10 μL，測得峰面積并計算得二苯乙烯苷含量RSD為0.59%，表明該法重復性良好。

2.6.5回收率試驗精密量取6份已知含量的樣品，分別加入一定量二苯乙烯苷對照品，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見表1。計算得二苯乙烯苷的平均加樣回收率為99.45%，RSD為1.56%，表明該法準確度良好。

表1 加樣回收率試驗結果

2.6 含量測定

取制備好的供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，進樣10 μL，測定二苯乙烯苷峰面積，代入標準曲線計算，得烏發生發液中二苯乙烯苷含量1.73 μg/mL。結果見圖1。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗比較了不同流動相系統的可行性，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸溶液等，結果表明采用乙腈-水溶液為流動相時，基線較平穩，目標峰無拖尾和前延，靈敏度高，分離度較好，故該實驗中流動相采用乙腈-水溶液；再對此流動相不同比例(20∶80、25∶75、30∶70)進行考察，結果發現所用比例乙腈-水(25∶75)分離度最好，并且最大限度地節省了分析時間。

3.2 供試品制備方法選擇

本試驗比較了不同提取溶媒(70%甲醇、稀乙醇)，不同提取方法(超聲、水浴回流)和提取時間(15 min、30 min、45 min)，從二苯乙烯苷含量、節約成本、便捷性等角度進行考察，確定了采用稀乙醇作為提取溶媒，超聲提取30 min進行供試品溶液的制備。

圖1二苯乙烯苷對照品(A)、烏發生發液樣品(B)和陰性樣品(C)的HPLC圖譜

目前西醫臨床針對SA主要以外科手術、藥物治療為主，盡管療效肯定，但大多數西藥只能減少毛發脫落，且副作用較明顯，某些藥物雖能促進毛發再生，但停藥后的繼續脫發使得其療效難以維持；縫縮術和植發術等外科手術方法，雖可改善禿發的不良視覺，達到一定的美容效果，但術后往往頭發外觀不自然，對于本身供區頭發稀少的患者，手術難以實施；另外，禿發面積較大的患者需多次植發，手術費用高[8]。中醫治療SA方法多樣，注重標本兼治，從整體上調節機體內分泌功能，在改善癥狀、延緩病程方面已取得較好的臨床療效，但其復雜的成分體系使得其藥效物質基礎研究困難。因此，本研究通過高效液相法測定烏發生發液中二苯乙烯苷的含量，不僅為本制劑的質量標準提供依據，同時對于該產品治療SA的物質基礎研究具有重要意義。