胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞增殖及垂體瘤轉化相關基因表達的影響?

張順榮，李東芳，何寄琴，焦 蕉，唐繼云，李玉明，何 欣，周 珉，吳 鴻

(1. 廣西國際壯醫醫院，南寧 530201； 2. 中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，長沙 410013；3. 長沙市第八醫院腫瘤科，長沙 410100； 4. 衡陽市中醫院，湖南 衡陽 421000)

我國胃癌的發病率呈不斷上升趨勢[1]。據國家癌癥研究機構報告，2012 年中國胃癌發病率和死亡率分別位于全球第5、6位，發病例數和死亡例數分別占全球胃癌發病和死亡的42.6% 和45.0%[2]。胃癌目前的治療現狀雖取得一定進展，但對于中晚期胃癌總體療效仍不容樂觀，因此開發新藥及探索多學科治療模式成為必然。中醫藥在中晚期胃癌治療中協同放化療增效減毒或通過扶正祛邪，改善癥狀，延長患者生存期，成為一種重要的替補治療。

胃癌的發生發展機制復雜，涉及多因素、多步驟、多基因突變，導致細胞惡性增殖和無序凋亡，其中細胞惡性增殖是腫瘤發生的生物學基礎，因此有效抑制腫瘤細胞的增殖是研究抗腫瘤藥物的關鍵。胃復方是臨床治療胃癌的經驗方，通過前期研究發現，胃復方抑制裸鼠移植瘤的生長與下調垂體瘤轉化基(pituitary tumor transforming gene,PTTG)、骨髓細胞瘤病毒(cellular-myelocytomatosis viral oncogene, c-Myc)、人端粒酶逆轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因表達有關。為進一步證實其作用機制設計本實驗，觀察胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞增殖及PTTG相關基因及蛋白表達的影響，為胃復方治療胃癌提供理論依據。本實驗開展獲得中南大學湘雅醫院附屬腫瘤醫院動物倫理委員會審批。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞株 SD SPF級大鼠30只，體質量(200±20)g，雌雄各半，購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司(使用許可證號SYXK(湘)2014—0016，生產許可證號SCXK(湘)2011-0003)。人胃癌BGC-823細胞株購自武漢博士德公司，用含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640培養基，于飽和濕度培養箱中培養(37 ℃，5%CO2)，按1∶2進行傳代培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.1.2 藥物與試劑 氟尿嘧啶注射液(10 ml 0.25 g，產品批號FA150611)，上海旭東海普。1640培養基(Hyclone)、胎牛血清(FBS)(Gibco)、胰酶消化液(碧云天)、DMSO(國藥集團)、MTT試劑盒(美國Sigma公司)、細胞周期試劑盒(凱基生物)、Trizon Reagent、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA、UltraSYBR Mixture(CWBIO 康為世紀)。

1.1.3 主要設備與儀器 臺式冷凍離心機(中國深圳黑馬)、多功能酶標分析儀(匯松)、恒溫培養箱(光明)、超凈工作臺(北京亞泰隆)、倒置顯微鏡(北京中顯恒業儀器)、正置熒光顯微鏡(Motic)、熒光PCR儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)。

1.1.4 中藥混懸液 胃復方組成：黃芪、黨參、白術、茯苓、香附、郁金、蘇木、莪術、蚤休、半枝蓮、女貞子、菟絲子、白花蛇舌草、甘草、雞內金、炒麥芽、炒谷芽共200 g。所有生藥購自湖南省腫瘤醫院中藥房，并經湖南中醫藥大學藥學院教研室鑒定，常規水煎水浴濃縮至生藥含藥量0.6 g/ml，灌裝滅菌置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.5 含藥血漿的制備 將SD大鼠按隨機數字表法分成5組，分別為空白對照組、胃復方高劑量組1.8 g/ml(相當于人臨床用藥量的4倍)、中劑量組0.9 g/ml(相當于人臨床用藥量的2倍)、低劑量組0.45 g/ml(相當于人臨床用藥量)、5-Fu陽性對照組各6只。中藥組灌胃每次2 ml，每日2次(9 am，4 pm)，連續7 d。空白對照組灌服等量生理鹽水，西藥對照組每日按4 mg/200 g 5-Fu腹腔注射，隔日1次，連續4次。各組末次給藥后2 h，用5%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，同組大鼠的血液混勻后合裝于肝素抗凝管，經3000 r/min離心，10 min后收集血漿，0.22 μm濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min，分裝置-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞增殖 取活力大于95%的對數生長期細胞，以1×105接種于96孔培養板內，每組6孔，每組3個復孔，每孔200 μL，用無血漿RPMI-1640培養24 h使細胞生長為G0期。用各組含藥血漿培養細胞24、48、72 h后更換培養液，每孔加入MTT(5.0 mg/mL)溶液50 μL，繼續培養4 h后離心、吸棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱繼續孵育，待結晶物充分溶解后，采用酶標儀測定490 nm 處(630 nm 為參照波長)的吸光度(OD)值，分別計算每組平均抑制率(IR)。抑制率=(空白血清對照組OD 值-實驗組OD值)/空白血清對照組OD 值×100%，并繪制細胞抑制率曲線。

1.2.2 流式細胞術檢測人胃癌BGC-823細胞周期 將細胞用RPMI-1640培養液調成濃度1×106/mL的細胞懸液，接種于6孔培養板中培養，分為空白血漿組、5-Fu對照組、胃復方低、中、高劑量組，每組3個復孔，吸棄孔內培養基，空白組和5-Fu組分別加入空白血漿和5-Fu含藥血漿，其余3組分別加入胃復方低、中、高劑量含藥血漿，分別刺激72 h 后，胰酶消化收集細胞。用400 μlPBS使細胞分離，調整加入預冷的乙醇濃度為75%，低溫過夜固定。取出固定樣品離心棄上清，重復1～2次去乙醇，加入150 μl PI(典化丙啶)工作液，4 ℃避光染色30 min。染色完成后24 h內用流式細胞儀在固定波長處檢測熒光強度及散射情況。

1.2.3 熒光定量法檢測PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA表達 表1顯示，細胞以1×106/ml密度接種于6孔細胞培養板中培養，空白組加入無含藥血漿，5-Fu對照組及胃復方組低、中、高劑量組加入相應濃度的含藥血漿；在加入藥物的72 h后，Trizol法提取細胞總RNA，在260 nm和280 nm處測定OD值，計算濃度及純度；M-MLV法將總RNA逆轉錄為cDNA；采用SYBR法在qPCR儀上檢測PTTG、C-Myc及hTERT基因表達水平；以GAPDH為內參基因，通過2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測PTTG、c-Myc、hTERT蛋白的表達 細胞培養及分組同上1.2.3；收集藥物處理72 h后的細胞，提取細胞總蛋白，按照BCA蛋白定量測定蛋白濃度，按照比例加入蛋白緩沖液煮沸5 min分裝，-80 ℃保存備用。將配置好的4%的濃縮膠加入10%的分離膠，然后將梳子插入，室溫下待膠凝固；然后取相同含量的各蛋白樣品，分別與裂解液混勻，煮沸5 min置于冰盒中速冷；加樣：第一孔點入彩色染料maker，余每孔加已變性的蛋白開始電泳。電泳后開始轉膜、封閉，一抗室溫孵育、二抗室溫孵育，將ECL化學發光液(Thermo)與膜孵育3 min，混合反應后約1 min，在凝膠成像系統上曝光。分別檢測PTTG、c-Myc、hTERT蛋白表達水平，β-actin為內參。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 胃復方含藥血漿抑制人胃癌BGC-823細胞增殖活性

表2圖1顯示，與空白對照組比較，5-Fu對照組和胃復方低、中、高劑量各組在分別刺激胃癌BGC-823 細胞24 h、48 h、72 h后的OD 值均降低，中藥組按濃度從低至高的順序，其OD值依次降低并與刺激時長呈負相關。其中72 h時段，各組OD值比較差異有統計學意義(P<0.05)，因此后續實驗取72 h，抑制率(IR)依次升高并與刺激時長呈正相關。其中72 h內不同濃度含藥血漿隨著時間延長抑制率逐漸增強，但到72 h及之后強度呈下降趨勢。

表2 胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823 細胞增殖的抑制作用

注：含藥血漿培養人胃癌BGC-823細胞同一時段OD值比較：與空白血漿組比較:*P<0.05；與胃復方低劑量組比較:&P<0.05；與胃復方中劑量組比較:☆P<0.05；與5-Fu組比較:#P<0.05

圖2 胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞周期影響比較

圖1 胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823 細胞增殖的抑制作用

2.2 胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞周期的影響

表3圖2顯示，與空白對照組比較，5-Fu對照組和胃復方低、中、高劑量組分別作用于人胃癌BGC-823細胞72 h后，其G0/G1期細胞比率增加(P<0.05)，S期和G2/M 期均減少(P<0.05)，其中G0/G1期細胞比率隨著胃復方濃度提高而增加，與胃復方濃度呈正相關，S期和G2/M 期隨著胃復方濃度的提高而減少，與胃復方濃度呈負相關。

表3 胃復方含藥血漿對人胃癌BGC-823細胞周期影響比較

注：與空白組比較:*P<0.05；與5-FU組比較比較:#P<0.05；與復方低劑量組比較:&P<0.05；與復方中劑量組比較:☆P<0.05

2.3 人胃癌BGC-823細胞中PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達結果

表4圖3顯示，與空白對照組比較，藥物組均能下調PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達水平(P<0.05，P<0.01)，隨著中藥劑量的升高而下調效果更明顯，呈劑量依賴性。與胃復方低、中劑量組比較，胃復方高劑量組、5-Fu組明顯下調PTTG、c-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達量(P<0.05)。Western biot法對各組細胞進行檢測蛋白表達條帶。

表4 藥物組對人胃癌BGC-823細胞PTTG、C-myc、hTERT的mRNA及蛋白表達影響比較

注：與空白對照組比較:*P<0.05，**P<0.01；與胃復方低劑量組比較:△P<0.05；與胃復方中劑量組比較:▉P<0.05

圖3 藥物組對人胃癌BGC-823細胞中PTTG、C-myc、hTERT蛋白表達的影響

3 討論

垂體瘤轉化基因(pitui tary tumor-transfo rming gene，PTTG)是一種腫瘤轉化基因，其突變可以影響腫瘤細胞增殖及凋亡進程[3-4]。原癌基因(c-Myc)是一種與細胞周期密切的核癌基因，它是PTTG下游靶基因，影響細胞生長、增殖、分化，與人類許多腫瘤發生轉歸相關[5-6]。近年來，相繼在多種腫瘤中檢測到c-Myc高表達, 同時常伴隨其調控上游蛋白PTTG異常表達。有學者提出：“c-Myc-hTERT-細胞無限增殖化”學說，因此基于“PTTG-c-Myc-hTERT-細胞增殖”途徑，探索中醫藥治療胃癌的可能作用機制，為中醫藥研究提供新思路。

胃復方是湖南省腫瘤醫院中醫科臨床經驗方，主要功效為健脾益氣、化瘀解毒，經過30余年的臨床實踐，對胃癌患者具有較好的臨床療效[7-8]。課題組前期研究證實，胃復方含藥血漿能抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，誘導凋亡，同時也能夠抑制裸鼠移植瘤的生長[9-10]。本實驗采用MTT法進一步證實，胃復方不同濃度含藥血漿有效抑制人胃癌BGC-823細胞增殖，并呈劑量及時間依賴性。同時運用流式細胞術檢測細胞周期，發現其可以阻滯BGC-823細胞由G0/G1 期進入S期，抑制細胞生長。這與國內針對其中某些單藥提取物的研究結果相仿。如[11-13]黃芪提取物黃芪多糖、蚤休提取物總皂苷、白術水提取物能夠抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖，誘導其凋亡。吉愛軍等[14]發現，三棱、莪術的水提取物能夠阻止細胞無限制從G1 期進入S期，產生細胞增殖抑制及促進凋亡的作用。實驗發現[15]，溫莪術大小劑量、廣莪術大中劑量及蓬莪術中劑量含藥血清在加藥后48 h 都能抑制胃癌BGC823的細胞增殖。

實驗結果還提示，胃復方含藥血漿作用細胞后可下調PTTG、C-Myc、hTERT的mRNA及蛋白表達水平。現代藥理學研究表明，本研究中所用藥材含有效成分，如黃酮類化合物、黨參多糖、半枝蓮多糖、白花蛇舌草多糖、重樓皂苷、莪術提取物欖香烯、莪術醇等均對多種癌細胞有抑制作用[16-21]，這些有效成分可能構成抗腫瘤的物質基礎。

綜上所述，胃復方含藥血漿可能下調PTTG、c-Myc、hTERT mRNA和蛋白表達來抑制人胃癌BGC-823細胞增殖，阻滯細胞周期進程，從而發揮抗腫瘤作用，為臨床提供重要的理論依據，其機制值得深入研究。