津力達顆粒對PCOS模型大鼠卵巢TGF-β/CTGF的影響?

邵 飛，沈山梅，劉佳怡，張冰潔，喬程程，李憶昆，楊家苗，燕 歌，畢 艷，朱大龍

(1.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床醫學院,南京 210008；2. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院內分泌科,南京 210008)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是較常見的引起育齡婦女內分泌紊亂的疾病，累及5%～10%的育齡婦女[1]。我國育齡期婦女的患病率約為5.6%[2]。PCOS的特點是排卵功能障礙和雄激素過多，其主要臨床表現為月經不調、多毛癥、痤瘡、脫發和不孕癥等[3]。但PCOS發病機制至今尚未完全明確，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)及其代償表現高胰島素血癥(hyperinsulinism，HI)在PCOS的發生發展中起重要作用[4]，慢性炎癥、卵巢間質纖維化也與PCOS發病有著密切關系[5]。卵泡細胞間隙增大，間質膠原纖維增多是引起PCOS患者卵泡發育的重要生理病理原因之一[6]。轉化生長因子(transforming growth factor-beta TGF-β1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)能夠促進卵巢纖維化，導致卵巢功能下降[7]。本實驗旨在探討津力達顆粒對模型大鼠卵巢TGF-β1、CTGF表達的改變，以期為津力達顆粒治療PCOS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料

50只體質量為40～50 g清潔級21 d齡雌性SD大鼠，購買于南京醫科大學動物繁殖中心，飼養于南京鼓樓醫院動物實驗中心，實驗室溫度(23±2)℃，相對濕度40%～60%，光照時間每天9∶00～21∶00，常規飼料喂養，自由攝食飲水。動物墊料及飼料均由南京鼓樓醫院動物實驗中心提供。

1.2 藥物及試劑

注射用脫氫表雄酮(購自武漢華美華科技(集團)有限公司上海分公司)；二甲雙胍(購自中美上海施貴寶制藥有限公司)；注射用油劑(購自安徽宇博化工有限公司)；津力達顆粒(購自石家莊以嶺藥業股份有限公司)；SYBR green(購自美國ABI生物公司)；GAPDH、TGF-β1、CTGF兔抗鼠源性一抗(購自Santa CRUZshen生物公司)；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(購自武漢博士生物科技公司)；PCR引物(北京奧科生物有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立 SD大鼠常規適應性喂養7 d，隨機取40只，于頸背部皮下注射DHEA(6 mg/100 g)+ 注射用油劑(0.2 mL)，連續20 d。20 d后在光學顯微鏡下觀察大鼠的陰道涂片，連續4 d，即大鼠的1個動情周期。觀察到大鼠陰道上皮持續角化，失去動情周期則造模成功，否則為造模失敗應予剔除。同時模型組隨機處死4只大鼠，行卵巢HE染色，以進一步證實造模結果。

1.3.2 動物分組及給藥 造模第21天后給藥，將成模大鼠按隨機數字表法分為模型組、津力達組、二甲雙胍組及津力達+二甲雙胍組。藥物干預組給予相對應藥物灌胃：二甲雙胍0.265 g/(kg·d)以265 mg/mL溶于生理鹽水中；津力達顆粒 50 mg/(kg·d)以10 mg/mL溶于生理鹽水中，每日1次灌胃，連續28 d(約7個大鼠動情周期)。空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續28 d。模型組及各藥物干預組持續皮下注射DHEA，以防止其自身恢復排卵。

1.3.3 血清中TGF-β1、CTGF水平測定 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈取血4～5 mL，以3000 r/min離心10 min，留取上清。酶聯免疫吸附試驗(ELASA法)檢測血清中TGF-β1、CTGF、INS，最低檢測濃度分別為<0.1 ng/mL、<0.1 ng/mL、<0.1 mU/L。各指標板內、板間變異系數均小于15%。取出反應板，依次加入標本、標準品、辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，經過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。

1.3.4 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達 將冰凍的卵巢組織解凍并稱量重量，加入組織裂解液提取蛋白。取30ug蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯模，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入1∶2000稀釋的GAPDH抗體、TGF-β1抗體、CTGF抗體，4 ℃過夜。第2天洗膜后加入1∶5000稀釋二抗，室溫孵育1 h再次洗膜，最后采用化學發光試劑盒暗室顯影。

1.3.5 qRT-PCR檢測卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表達 Trizol法提取卵巢組織總RNA，逆轉錄制備cDNA, qRT-PCR采用Syber Green I GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，檢測卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表達, 以GAPDH基因為內參。TGF-β1 Forward 5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG- 3’，Reverse 5’-TGGGACTGATCCCATTGATT- 3’；CTGF Forward 5’-GGGCCTCTTCTGCGATTC-3’， Reverse 5’- ATCCAGGCAAGTCAGGTA- 3’；GAPDH Forward 5’-TGGATTTGGACGCATTGGTC- 3’，Reverse 5’- TTTGCACTGGTACGTGTTGAT- 3’。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 SD大鼠造模結果評估

圖1顯示，空白組模型大鼠陰道涂片可見大量核上皮細胞、角化上皮以及白細胞，提示空白組大鼠存在動情周期變化；模型組大鼠陰道涂片僅見大量白細胞，提示模型組大鼠失去動情周期變化。空白組大鼠卵巢HE染色未見卵巢多囊樣變，可見卵母細胞及其周圍原始卵泡，以及不同發育階段的卵泡及多個黃體，顆粒細胞呈多層，形態完整，排列整齊。其余各組大鼠卵巢HE染色，見卵巢呈多囊樣改變，卵泡體積增大，閉鎖卵泡增多，顆粒層細胞減少，卵泡細胞之間間隙增大。本實驗中SD大鼠均造模成功。

2.2 各組血清TGF-β1、CTGF水平

表1顯示，模型組TGF-β1、CTGF水平較空白組顯著升高(P<0.01)，各治療組TGF-β1水平較模型組均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲雙胍組血清CTGF較模型組降低(P<0.05)；津力達+二甲雙胍組血清CTGF較模型組顯著降低(P<0.01)。

表1 各組TGF-β1、CTGF血清學結果比較

注：正常對照組比較：△P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.3 各組卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達及mRNA水平

圖2表2顯示，模型組TGF-β1、CTGF蛋白表達及mRNA水平較空白組增高(P<0.05)；二甲雙胍組、津力達+二甲雙胍組卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表達及mRNA水平低于模型組(P<0.05)；津力達組卵巢TGF-β1蛋白表達低于模型組(P<0.05)，在TGF-β1、CTGF mRNA水平低于模型組(P<0.05)。

注：1：空白組；2：模型組；3：津力達組；4：二甲雙胍組；5：津力達+二甲雙胍組圖2 各組大鼠卵巢組織中TGF-β1、CTGF表達比較

表2 各組TGF-β1、CTGF蛋白及mRNA表達結果比較

注：正常對照組比較:△P<0.01；與模型組比較:#P<0.05

3 討論

PCOS的發病機制目前尚不明確，與遺傳及環境因素密切相關，涉及神經內分泌及免疫系統的復雜調控網絡[8]。近年研究表明，卵巢纖維化是多囊卵巢因素的發病機制之一，主要引起卵巢結構破壞和功能紊亂[9]。卵巢纖維化可由不同因素引起，如手術、炎癥以及免疫異常。在組織修復期間，細胞因子如TGF-β1、CTGF等相互作用促進ECM沉積，最終引起卵巢纖維化的發生發展。Wang等研究發現，在DHEA誘導的大鼠卵巢中，纖維蛋白和膠原蛋白具有更高的水平，而主要纖維化標志物如TGF-β1、CTGF明顯上調[6]。本研究結果提示，在造模結束后模型組大鼠陰道上皮持續角化，失去動情周期；同時HE染色鏡下可見卵巢多囊樣變,卵泡腔增大，白膜明顯增厚，閉鎖卵泡增多，顆粒細胞層減少；卵巢組織蛋白水平提示模型組TGF-β1、CTGF顯著高于空白組，提示PCOS模型制造成功。

中醫學認為，PCOS發病三臟功能失調及痰濕、瘀血、內熱等多種病理因素有關。PCOS患者卵巢在病變初期表現為脾虛濕盛，脾失健運，水濕內停，聚濕成痰，久則濕熱內蘊、濕熱交阻、灼津為痰；病至后期，則內生痰濁、痰瘀互結、郁阻血脈、膠固難除。肝脾腎功能不全以及痰、瘀、濕等停聚于卵巢可引起卵巢增大、卵泡發育不全以及局部炎癥因子增多引起卵泡細胞間隙增大、間質膠原纖維增生等變化。津力達顆粒由人參、黃精、麩炒蒼術、苦參、麥冬、地黃、制何首烏、山茱萸、茯苓、佩蘭、黃連、知母、炙淫羊藿、丹參、粉葛、荔枝核、地骨皮等17味中藥組成，以益氣養陰、健脾運津兼以補腎活血祛瘀。痰、瘀、濕等病理因素改善，一定程度可改善卵巢病理變化。本研究中，模型組TGF-β1、CTGF水平在血清學水平、蛋白及mRNA水平要明顯高于空白組。TGF-β1水平異常升高可引起卵泡發育不良和排卵障礙[9]。Lee等研究表明，TGF-β1表達的降低可防止DHEA誘導的高雄激素狀態[12]。CTGF是目前所發現的與PCOS相關且較為重要的生長因子之一。既往研究發現，CTGF在PCOS模型大鼠中的卵巢顆粒細胞中高表達[13]。國內學者證實，CTGF在PCOS模型大鼠中高表達，同時發現抑制CTGF的表達可通過PI3K/AKT通路降低顆粒細胞增殖并誘導其凋亡[14]，以及促進組織修復功能和恢復正常結構功能。CTGF是TGF-β1的下游反應元件，與TGF-β1相似的生物學功能，具有促進細胞增殖，增強細胞的表達黏附分子，促進膠原蛋白合成和特定細胞分泌ECM[15-16]。TGF-β1和CTGF之間的相互作用調節組織纖維化的發展和進展[17]。TGF-β1誘導的CTGF進一步作用于間充質成纖維細胞，通過旁分泌機制反過來刺激TGF-β1的分泌。纖維發生時發生，過表達TGF-β1上調表達其下游反應元件CTGF和刺激物ECM的生產，二者相互影響并進一步促進膠原蛋白生成的增加并加速發展。阻斷TGF-β1可抑制TGF-β1信號通路，阻止纖維化的發展。本實驗結果表明，津力達顆粒干預后大鼠血清TGF-β1及CTGF有降低趨勢，與二甲雙胍聯用二者降低趨勢更加明顯。卵巢組織蛋白及mRNA水平也提示，津力達顆粒能夠降低TGF-β1、CTGF表達，與單用二甲雙胍組比較差異無統計學意義，而與二甲雙胍聯用后可顯著降低TGF-β1、CTGF水平。

綜上所述，DHEA誘導的PCOS模型大鼠經津力顆粒達干預后TGF-β1、CTGF水平明顯下降，提示津力達對PCOS的卵巢纖維化有一定預防和改善作用，其機制可能是通過調節卵巢組織中TGF-β1、CTGF的表達水平。