基于核磁共振的栝樓-薤白煎劑代謝組學研究?

阮美丹，曾祥法，韓林濤，李晶晶

(湖北中醫藥大學基礎醫學院，武漢 430065)

栝樓-薤白是中醫治療胸痹的經典藥對，栝樓、薤白二者為伍滌上焦之痰濁，散陰寒之凝滯，寬胸中之閉塞，使固寒痰滯得解，胸陽得振而平，為治療胸陽不振、寒痰濕濁凝滯于胸中之胸痹心痛的最佳組合[1]。現代藥理研究表明，栝樓能擴張冠狀動脈，增加血流量，提高耐缺氧能力[2]，保護缺血心肌；薤白具有調血脂、抗動脈粥樣硬化[3]、抑制血小板聚集、抗氧化[4]、保護心肌缺氧缺血及缺血再灌注心肌損傷等作用[5]。由于中藥成分復雜，栝樓-薤白藥對在治療慢性心肌缺血產生的整體藥效及其作用機理一直是現代研究的難點。代謝組學(Metabonomics)是通過對生物系統因病理生理或基因改變等刺激所致動態多參數代謝應答的定量測定，了解生物體內源性代謝物質的整體及其變化規律的科學[6-7]。本實驗運用核磁共振技術和代謝組學方法，對慢性心肌缺血大鼠血清代謝物進行分析，尋找慢性心肌缺血的生物標志物，研究其對應的代謝通路來闡明栝樓-薤白藥對治療慢性心肌缺血大鼠的作用機理。

1 材料

1.1 儀器

600 MHz帶超低溫探頭的核磁質譜儀Bruker Avance III 600 MHz NMR sepctrometer equipped with inverse detedtion cryoprobe(Bruker BiospinRheinstetten,Germany)；渦旋儀，低溫真空離心機(SC110 A，Thermo，Germany);Synergy Ultrapure Water System From Millipore(Billerica，MA);光學顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡)。

1.2 藥品和試劑

栝樓(購于湖北強康中藥飲片有限公司，批號161101)、薤白(購于湖北強康中藥飲片有限公司，批號161001)，分別經湖北中醫藥大學中藥教研室楊紅兵鑒定為葫蘆科植物栝樓(Trichosanthes kirilowi)的干燥藥材和百合科植物薤白(Allii macrostemi bulbus)的干燥藥材。甲醇、磷酸鈉(TSP)購于Sigma-Aldrich(St.louis，MO，USA)、低濃度米釀酒、石蠟(國藥集團，貨號69019361)、二甲苯(國藥集團，貨號10023418)、蘇木素、伊紅Y(水溶性)，乙醇(國藥集團，貨號10009218)、多聚甲醛、鹽酸異丙腎上腺素(ISO)。

2 方法

2.1 分組造模

表1顯示， 將18只SD雄性大鼠按隨機數字表法分為栝樓-薤白組、模型組、正常組3組各6只。模型的建立參照文獻[8-9]，采用小劑量長時間給予大鼠鹽酸異丙腎上腺素造成慢性心肌缺血模型，栝樓-薤白組和模型組分別連續腹腔注射6 d ISO 0.04 mg/kg制造慢性心肌缺血模型，正常組腹腔注射生理鹽水0.04 mg/kg。按慢性心肌缺血陽性判斷標準：以ST 段水平向下或向上偏移≥0.11 mv；T波高聳；超過同導聯R波的1/2；T波高聳伴ST 段移位；符合其中之一者即可。造模后，各組ST段電壓會有所抬高，提示造模成功。給藥后，栝樓-薤白組ST段電壓下降，說明栝樓-薤白藥對對慢性心肌缺血大鼠有治療作用。

表1 栝樓-薤白對慢性心肌缺血大鼠ST段影響比較

注：與正常組比較：P*<0.05，P**<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 給藥取材

取栝樓實25 g(栝樓子12.5 g、栝樓皮12.5 g)，薤白12.5 g，白酒7 L(低濃度米釀酒，1400 mL)共煎，濃縮至2 L(400 mL)，栝樓-薤白含生藥量為1.875 g/ml，按比例制備足夠數量，保存在-80 ℃低溫冰箱中，臨用時取出。栝樓-薤白組大鼠灌服栝樓-薤白煎液，模型組、正常組灌服生理鹽水。各組每日灌胃1次，灌胃容量20 mL/kg。大鼠放置在SPF級室內飼養，晚上定時投放食料，自由飲水，連續給藥14 d。末次給藥后禁食12 h，第2天上午進行取材。

2.3 樣本制備及前處理 連續給藥14 d后，所有大鼠用10%的水合氯醛(4 mL/kg)進行麻醉，然后斷頭取血，用加EDTA-K2抗凝劑采血管收集血液，血液于3000 rpm離心10 min，取血清放到-20 ℃低溫保存以備用。另外采用全自動生化分析儀檢測血清中的中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。分別取動物心臟，用生理鹽水洗凈，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，HE染色，梯度乙醇脫水、封片以備用。

取出冰凍血清樣本，4 ℃解凍操作，渦旋30 s，取300 μL血樣加入-20 ℃預冷的甲醇渦旋10 s，放置-20 ℃環境20 min冰凍處理。然后進行離心處理：4 ℃ 12000 r/min，10 min離心，取上層清液保存到新編號的離心管中。使用低溫真空離心機去甲醇溶劑后，加入550 μL磷酸緩沖溶液(0.1 M, 50%D2O, 0.1%NaN3, 0.001%TSP-d6)復溶。渦旋1 min，離心10 min，4 ℃ 12000 r/min。取500 μL上清液于5 mm標準核磁管中待測。

2.4 1H NMR檢測

將上述處理好的樣品分別利用NMR儀器進行數據檢測，最后使用Bruker Biospin v2.1 workstation software (Bruker, Gremany) 對18個樣本的1H NMR自由感應衰減(Free Induction Decay, FID)信號進行傅立葉轉換，調整相位，校準基線，以TSP(δ0.00)為全部譜圖化學位移的標準。對δ0.5～δ9.5范圍內的譜峰進行對齊分析，按照0.01 ppm單位的化學位移寬度進行分段積分處理。為防止水峰殘留信號的干擾，除去水峰壓制區段(4.81～ 5.18 ppm)的分段積分值，同時去除部分樣本中甲醇的信號峰干擾段(3.358～3.368ppm)。然后將每張譜圖所有積分段的面積值進行歸一化處理，且對不同樣本完成體積歸一化，導出包含873個分段及其對應積分面積值的數據矩陣。最后將數據矩陣導入在線軟件MetaboAnalyst 4.0分析平臺，實現可視化并進行多元統計分析。

3 結果

3.1 大鼠血清酶活性及心臟病理切片分析

3.1.1 血清酶影響 表2顯示，與正常組比較，模型組CK、CK-MB、LDH酶的活性顯著升高。與模型組比較，栝樓-薤白37.5 g/kg能降低血清CK、CK-MB、LDH酶的活性。

表2 栝樓-薤白對慢性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB、LDH活性影響比較

注：與正常組比較：P*<0.05，P**<0.01；與模型組比較：P△<0.05，P△△<0.01

3.1.2 心臟病理切片分析 圖1顯示，將大鼠心臟切片于光學顯微鏡下觀察(×200)。結果顯示，正常組細胞結構比較清晰，肌纖維排列整齊，肌漿染色均勻，細胞核居中，細胞間有一定的間隔，未見炎性細胞浸潤和水腫情況。模型組細胞結構模糊，排列紊亂，有大量的炎細胞浸潤，且細胞內可見大量空泡；細胞排列緊密，可見明顯的水腫情況。栝樓-薤白組細胞結構清晰，心肌纖維排列整齊，肌漿染色均勻，細胞核居中，少量炎細胞浸潤，細胞內未見明顯空泡存在，與正常組非常接近，與模型組比較有較大差異。

圖1 光鏡下心肌組織切片(×200)

3.2 1H NMR譜圖歸屬及多元統計分析

3.2.1 血清1H NMR譜圖歸屬 圖2～4表3顯示，采集的1H NMR譜圖中低場(δ5.18～9.50)信號較高場少，代謝物分布集中在δ2.0～δ5.0之間，在高場區域(δ0.0～δ4.8)中糖類物質的信號較強且堆疊而難辨識，一些有機酸類化合物信號的強度較低。本項目的所有信號歸屬根據譜圖中實際信號的化學位移、耦合裂分、半峰寬以及峰形等信息進行判斷，并結合evaluate版的Chenomx數據庫和相應文獻的參考情況進行歸屬指認。一共歸屬41種內源性代謝物，這些物質包括必須氨基酸苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸，非必須氨基酸甘氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺等，還有其他成分包括琥珀酸鹽、3-羥基丁酸、肉堿和葡萄糖等。

圖2 大鼠灌胃后血清NMR歸屬圖δ0～δ3ppm

圖3 大鼠灌胃后血清NMR歸屬圖δ3～δ5ppm

圖4 大鼠灌胃后血清NMR歸屬圖δ5～δ8ppm

3.2.2 多元統計分析結果 圖5顯示，運用代謝組學在線分析軟件Metaboanalyst 4.0平臺對代謝物依次進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA)，用以上統計分析方法反映2組間離散程度和尋找2組之間差異位點。PCA分析結果可以看出，模型組、栝樓-薤白組樣本均在95%的置信區間內，未出現異常點。

圖5 正常組(Z)與模型組(M)、栝樓-薤白組(Y)大鼠血清代謝物1H NMR的PCA得分圖

圖6、7顯示，根據PLS-DA的VIP圖和載荷圖可以找到對樣本具有重要作用以及它們在樣本區分中貢獻率較大的代謝物分析結果。由得分圖6中顯示，模型組和正常組樣本明顯分離，說明它們代謝輪廓相異，而組內樣本團聚在一起，說明樣本具有較高的重復性。在交叉驗證(cross-validation, CV)中模型組與正常組結果顯示,R2=0.998表示模型建立的準確度很高，而Q2=0.554表示模型穩定性好，預測能力高，過擬合風險低。

圖6 正常組(Z)與模型組(M)大鼠血清代謝物1H NMR的PLS-DA得分圖和VIP圖及載荷圖

圖7 栝樓-薤白組(Y)與模型組(M)大鼠血清代謝物1H NMR的PLS-DA得分圖和VIP圖及載荷圖

3.3 生物標志物的確定及差異分析

表3顯示，根據核磁共振一維圖譜標志物的化學位以及數據的多元統計分析結果，載荷圖上距離原點越遠代表代謝物對樣本的貢獻越大，再結合具有顯著差異性(P<0.05)的和PLS-DA圖中VIP >1的化合物以代謝物作為潛在生物標志物。在利用HMDB數據庫確定代謝物的同時，還結合evaluate版的Chenomx數據庫及相關文獻[10]進行指認，代謝物名稱以Chenomx數據庫表述方式為依據。最終對慢性心肌缺血潛在生物標志物鑒定的結果及其含量變化趨勢。

表3 生物標志物及其變化趨勢比較

注：“↑”為代謝含量升高，“↓”為代謝含量降低，箭頭數量為含量變化的幅度

慢性心肌缺血和栝樓-薤白治療導致大鼠血清代謝物的含量發生變化。表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠纈氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的含量降低，牛磺酸、琥珀酸、肌酸、3-羥基丁酸、肉堿的含量也降低，而脯氨酸、谷氨酸的含量未發生變化，但甜菜堿的含量卻升高。與模型組比較，栝樓-薤白組中除甜菜堿含量未發生變化外，其他代謝物的含量均顯著升高。

4 討論

研究結果顯示，慢性心肌缺血大鼠在栝樓-薤白治療后代謝物發生了明顯變化，主要影響的代謝途徑有能量代謝、氨基酸代謝和膽堿代謝。

琥珀酸作為三羧酸循環中的重要產物之一，在模型組中含量顯著下降，其消耗說明有氧糖酵解過程受到抑制。又由于心肌缺血時心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作，而心肌心臟活動所需要的能量幾乎完全靠有氧代謝產生的三磷酸腺苷(ATP)提供，當ATP消耗殆盡時肌酸能夠快速合成ATP，以供給心肌細胞正常的能量需求，參與體內的能量代謝，保證心肌的正常工作。

甜菜堿學名三甲基甘氨酸，可由甘氨酸在體內甲基化產生，最終可轉化生成乙酰膽堿參與信息傳導相關通路。表3顯示，模型組中甘氨酸的含量明顯下降，而甜菜堿含量升高，可見慢性心肌缺血大鼠體內很可能發生甘氨酸甲基化的過程，從而參與膽堿的代謝。

牛磺酸具有抑制血小板凝集與血栓形成、降低血脂、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗心力衰竭、保護心肌等作用。大量臨床資料證實，引起心肌損傷的多種因素均可使細胞內牛磺酸丟失，加速細胞受損[11]。在給藥后，牛磺酸的含量顯著升高，說明栝樓-薤白影響了牛磺酸的代謝，增加在血清中的含量從而修復受損的心肌細胞，達到治療慢性心肌缺血的目的。薤白辛、溫，與栝樓配伍通過胸中之陽氣而達到治療寒痰凝滯于胸中之胸痹心痛的作用，可能與牛磺酸的強心通陽有密切關系。由于牛磺酸與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關，而薤白中含有多種含硫化合物，這些化合物可能補充必要的硫元素而導致牛磺酸的含量升高，但其具體結果有待進一步的研究考證。

另外，前人已研究報道心血管類疾病與氨基酸的代謝異常相關[12]。模型組中谷氨酰胺的含量下降，使其合成受阻，導致谷胱甘肽的合成過程受阻。而谷胱甘肽的主要作用是保護細胞膜的完整性，故可知模型組中細胞膜的完整性受到損害。給藥后，栝樓-薤白組的谷氨酰胺的含量升高，可以推測栝樓-薤白對細胞膜受損有修復作用，進一步保護心肌缺血過程。前人研究表明，在能量耗盡的心臟中，纈氨酸可以適當地保護心肌損傷[13]。此外，絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸的含量均有明顯下降，可能合成酶和激素類物質保證機體的正常代謝，也可能發生脫氨基作用供給機體能量，但具體過程仍有待進一步研究。肉堿和3-羥基丁酸的含量變化表明，栝樓-薤白對慢性心肌缺血的治療還涉及到脂類代謝過程。

通過以上對相應代謝物含量變化分析，栝樓-薤白煎液可能主要是通過影響機體能量代謝、氨基酸代謝和膽堿代謝等相關通路來調節相關代謝物的含量，從而達到保護慢性心肌缺血的目的，但其具體的代謝通路仍有待進一步的研究確認。