補陽還五湯對高血壓模型大鼠心肌組織中AngⅡ/AT1R與PI3K/AKt軸的影響?

曲 怡，王建波，薛亞楠，鄧婷月，勇入琳，劉 路，張立德

(遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室，沈陽 110847)

高血壓是指以體循環動脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高為主要特征(收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg)，可伴有心腦腎等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征[1]。研究顯示，高血壓可導致血流動力學和神經體液等諸多異常變化，是引起心肌病理性改變的重要疾病之一。高血壓患者同時存在的壓力負荷和容量負荷均可增加心肌細胞容積，增大心肌細胞尺寸，改變膠原蛋白基質成分而最終引起心肌肥厚，是引起腦卒中、冠心病和腎功能損傷等疾病的重要危險因素。中醫將其歸屬于“眩暈”“頭痛”“肝風”等病證范疇。近年來中醫藥治療高血壓病取得了一定成效，并充分體現了臨床的實用價值[2-4]。

現代研究證實，腎素血管緊張素系統(RAS)參與高血壓的發病和心房重塑，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與其主要受體血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)結合后可改變心肌離子通道表達及功能，促進組織氧化張力及炎癥反應，引起心房纖維化和心肌肥大等[5]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路是胰島素調節細胞生理功能的主要信號通路，具有抗氧化、抗凋亡等心肌保護作用；原發性高血壓由于RAS過度激活，打破了RAS與胰島素信號之間串活平衡的本質，是RAS的主要效應因子AngⅡ表達上調后抑制了胰島素信號通路PI3K/AKT的活性[6-8]。研究發現，補陽還五湯在改善血液流變學、保護血管內皮細胞功能和逆轉高血壓左室肥厚、改善高血壓患者左室舒張功能方面均有明顯療效[9-10]。

因此，本實驗擬通過觀察補陽還五湯對高血壓模型大鼠的AngⅡ/AT1R與PI3K/AKt信號通路的影響，闡釋補陽還五湯對高血壓所致心肌損傷的保護機制。

1 材料

1.1 動物

實驗動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供：7周齡鹽抵抗大鼠(SS)10只，體質量190～210 g(許可證編號SCXK(京)2016-0006)；7周齡鹽敏感大鼠(DS)30只體質量190～210 g(許可證編號SCXK(京)2016-0006)。飼養環境：遼寧中醫藥大學實驗動物中心，溫度為22±1 ℃，濕度為45±5%。

1.2 儀器及試劑

智能無創血壓計(BP-2010 A日本)；熒光定量PCR儀(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm)、ABI Veriti 梯度PCR儀器(Applied Biosystems)、超微量紫外分光光度計(NanoDrop2000)、多功能酶標儀(SpectraMax I3,奧地利MD公司)。Trizol? Reagent(Invitrogen life technologies)；引物設計合成(北京博邁德基因技術有限公司)、PCR反轉試劑盒(ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit)、熒光定量PCR試劑盒(Agilent Technologies)；MinuteTM總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量測定試劑盒(凱基生物)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(凱基生物)、一抗兔抗大鼠AT1R(北京博奧森生物技術有限公司，bs-0630R)；AngⅡ ELISA試劑盒(Biotech公司，Cat.#EIA-3667)。

1.3 藥物制備

補陽還五湯，藥用：黃芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，當歸6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g；以上劑量為成人一日劑量，共52.5 g，按照成人和大鼠給藥量換算，100 g大鼠給藥量為0.55 g。將補陽還五湯水濃縮至0.55 g/ml后，分裝置于4 ℃冰箱保存備用(中藥購自遼寧省中醫院中藥局)。纈沙坦由魯南貝特制藥有限公司提供。

2 方法

2.1 分組與造模

所有大鼠統一于SPF級動物中心適應性飼養7 d后開始實驗。SS大鼠10只為正常組；DS大鼠30只隨機分為模型組、中藥組、西藥組。8% Nacl高鹽飼料(北京科奧協力飼料有限公司提供)喂食28 d，期間采用智能無創血壓計監測大鼠血壓，28 d后當血壓值升至140 mmHg/90 mmHg以上時，確定為高血壓大鼠模型。停止高鹽喂養改為普通飼料(遼寧本溪長生生物技術有限公司提供)喂養。中藥組和西藥組分別給予補陽還五湯、纈沙坦灌胃治療，飼養期間自由飲食飲水。

2.2 干預方法

中藥組大鼠給藥量(大鼠體質量每100 g給藥量為0.55 g/ml)，西藥組大鼠給藥量(3 mg/100 g大鼠)[11]，正常組和模型組大鼠給予等量蒸餾水灌胃，每天灌胃1次，連續灌胃5周。

2.3 取材

灌胃治療5周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉(4 ml/kg體質量)，待大鼠完全麻醉后打開大鼠胸腔，剪取左心室心肌組織置于無菌EP管內，迅速液氮浸泡后凍存于-80 ℃冰箱待用。

2.4 檢測方法

2.4.1 大鼠血壓的測量 測量方法：于安靜封閉的環境中，接好電源，打開主機，待設定溫度升高至39 ℃，將大鼠置于系統固定容器內，將感應器穿過鼠尾并固定于鼠尾根部，松緊適度，待動物安靜后尾套充氣系統自動加壓放氣，血壓儀顯示屏上觀察老鼠的血壓波形并記錄，每只大鼠重復測量3次取平均值。每只大鼠測量時間為30 min，避免大鼠躁動對血壓造成影響。

2.4.2 ELISA法檢測大鼠左心室心肌組織AngⅡ含量 取左心室心肌組織100 mg，加入PBS制成10%組織勻漿液，離心后取上清；設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔加入待測樣本50 μL，空白孔不加；除空白孔外其余各孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，封板膜封住反應孔，37 ℃水浴60 min；棄去液體，洗滌液反復洗滌5次；每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長測定各孔OD值；通過公式y=ax+b轉換計算AngⅡ含量。

2.4.3 Western blot法檢測左心室心肌組織內AT1R的蛋白表達 于冰箱中取出凍存的心臟組織，每組取3只老鼠，MinuteTM總蛋白提取試劑盒提取各組大鼠心臟組織蛋白，BCA蛋白定量測定試劑盒進行定量。80μg蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳及電轉移PVDF膜后，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST洗滌5次，5 min/次；HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5次，ECL檢測試劑盒進行曝光。GAPDH作為內參對蛋白條帶進行對比分析。

2.4.4 熒光定量PCR 法檢測大鼠左心室心肌組織 PI3K、AKt的mRNA表達 于冰箱內取出心臟組織，每組取3只老鼠，Trizol法提取總RNA后逆轉錄為cDNA,設定反轉條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個循環。表1顯示，熒光定量PCR儀進行基因表達量檢測，熔解反應按ABI 7500自動設定的條件進行，△△CT法對Real-time PCR結果進行定量分析。

2.5 統計學方法

表1 引物信息比較

3 結果

3.1 各組大鼠血壓變化比較

表2顯示，造模前后及治療后各組大鼠血壓變化比較。

表2 造模前后各組大鼠血壓變化比較

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05；與中藥組比較:#P<0.05

3.2 各組大鼠左心室心肌組織AngⅡ、AT1R含量比較

表3圖1顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織AngⅡ及AT1R表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠心肌組織AngⅡ、AT1R表達水平明顯下降(P<0.01)，且西藥組心肌組織AngⅡ、AT1R表達水平低于中藥組(P<0.01)。

圖1 各組大鼠左心室心肌組織AT1R含量比較

表3 各組大鼠左心室心肌組織AngⅡ、AT1R蛋白含量及PI3K、AKT mRNA含量比較

注：與正常組比較:*P<0.01；與模型組比較:△P<0.01；與中藥組比較:#P<0.01

3.3 各組大鼠左心室心肌組織PI3K、AKt mRNA表達比較

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織PI3K、AKt的mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠心肌組織PI3K、AKt的mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，且西藥組心肌組織AngⅡ表達水平高于中藥組(P<0.01)。

4 討論

伴隨著生活節奏的加快，緊張、肥胖、高鹽飲食等不良生活方式，使高血壓成為嚴重危害人類健康的主要疾病之一，也是亞洲的高流行區域，經年齡調整的高血壓患病率為20%～30%，且增長速率顯著快于西方國家[12]。近年來，此病的發病率呈現逐年上升趨勢。據統計，15歲以上人群的發病率約為11%，是冠心病、腦卒中等疾病的重要危險因素。研究證實，以高血壓為原發病的各種心腦血管疾病已成為人類死因之首。高血壓是一種多因素所致的疾病，與鹽的攝入密切相關，且高鹽攝入已成為高血壓病的一個獨立因素，Luft等率先提出鹽敏感性高血壓(SSH)的概念。大量流行病學和臨床研究證實，鈉鹽攝入過多是原發性高血壓發生發展的一個重要環境因素[13-17]。

RAAS作為調節血壓和體液平衡的典型循環與內分泌系統，在鹽敏感性高血壓的發病中起重要作用[18-19]。AngⅡ促進血管收縮和腎上腺皮質分泌的醛固酮具有保鈉排鉀的作用，促進鈉和水的重新收進而激活RAAS系統，引起血壓增高。目前研究認為，高鹽攝入引起的高血壓會使強心類物質增加而抑制鈉泵，最終導致血管平滑肌和心肌的收縮而引起高血壓[20-21]。AngⅡ/AT1R信號通路與心肌纖維化和心肌細胞凋亡等心肌損傷密切相關，此通路的激活還是心肌肥大發生的機制之一。對于高血壓來說，心肌肥大是對長期后負荷超載的血流動力學改變的一種適應性反應。研究證實，壓力負荷和容量負荷所造成的機械應力增加是心肌肥大的始發因素，高血壓大鼠存在心肌肥大的改變[22]。

PI3K/AKt是胰島素調節細胞的主要信號通路，除了具有調控細胞生長、存活、凋亡等重要功能，還在心肌保護中占有重要地位。在信號分子水平上表現為AngⅡ/AT1R信號通路與PI3K/AKt信號通路之間存在串活7074。大量證據表明，原發性高血壓由于RAS過度激活，打破了其與胰島素信號之間串活的平衡，最終導致胰島素信號通路失活的本質是RAS的主要效應因子AngⅡ表達上調后抑制了胰島素信號通路PI3K/AKt的活性[6, 23]。

在本實驗中，模型組大鼠AngⅡ、AT1R含量升高，PI3K、AKt mRNA下降，表明鹽敏感高血壓大鼠心肌組織的確有AngⅡ/AT1R信號通路的激活和PI3K/AKt信號通路的抑制。補陽還五湯可以顯著下調AngⅡ、AT1R的含量，上調PI3K、AKt mRNA的表達，表明補陽還五湯可以抑制AngⅡ/AT1R信號通路的激活，緩解AngⅡ/AT1R與PI3K/AKt信號通路的失衡狀態，降低血壓，保護心肌組織的損傷，延緩高血壓對靶器官的損傷。