HPLC法測(cè)定加味逍遙散復(fù)方中丹參酮ⅡA的含量

程金來(lái) 梁丹 冷靜

摘要：目的? 建立加味逍遙散復(fù)方中丹參酮ⅡA的測(cè)定方法。方法? 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（inertsil ODS-3柱 250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;流速：1.0 ml/min;柱溫：20℃。結(jié)果? 丹參酮ⅡA在0.0001～0.0005 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系[r=0.9991，平均回收率為97.36%（RSD=1.38%，n=6）]。結(jié)論? 本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，可用于加味逍遙散的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：加味逍遙散;含量測(cè)定;丹參酮ⅡA;HPLC

中圖分類(lèi)號(hào)：R286.0? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.052

文章編號(hào)：1006-1959（2020）02-0165-03

Abstract：Objective? To establish a method for determination of Tanshinone ⅡA in Jiawei Xiaoyao San compound. Methods? An octadecylsilane bonded silica column （inertsil ODS-3 column 250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used; Mobile phase： acetonitrile-0.1% phosphoric acid， gradient elution; detection wavelength： 270 nm; flow rate： 1.0 ml/min; column temperature： 20℃. Results? Tanshinone IIA showed a good linear relationship in the range of 0.0001 to 0.0005 μg [r=0.9991， the average recovery was 97.36% （RSD=1.38%， n=6）]. Conclusion? This method has strong specificity， high accuracy and good reproducibility， and can be used for the quality control of Jiawei Xiaoyao San.

Key words：Jiawei Xiaoyao San;Content determination;Tanshinone IIA;HPLC

逍遙散原方出自《太平惠民合劑局方》，具有調(diào)和肝脾，疏肝解郁，養(yǎng)血健脾的功效。加味逍遙散在此基礎(chǔ)上加味而成，全方方藥組成為：柴胡10 g、當(dāng)歸10 g、赤白芍15 g、黨參10 g、炒白術(shù)10 g、生甘草6 g、丹參20 g、炒二芽各10 g、延胡索15 g、丹皮10 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、梔子6 g、炒積實(shí)15 g、陳皮15 g。楊超[1]研究發(fā)現(xiàn)，加味逍遙散復(fù)方可以增強(qiáng)原發(fā)性肝癌患者實(shí)體瘤穩(wěn)定率、調(diào)節(jié)其肝功能并降低腫瘤標(biāo)志物的濃度。處方中丹參為主藥，丹參的主要成分為丹參酮ⅡA，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定不夠全面，為保證該處方的內(nèi)在質(zhì)量，研究采用高效液相色譜法（HPLC法）對(duì)該處方中丹參主要活性成分丹參酮ⅡA進(jìn)行定量研究。

1儀器與試藥

1.1儀器? Agilnt1260型高效液相色譜儀;KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）;GX-20型搖擺式中藥粉碎機(jī)（上海榮舒工貿(mào)有限公司）;SHB-Ⅲ循水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京高信儀器設(shè)備有限公司）;調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）;YP50001電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）;SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;RE52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）;TF881 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（吳江同豐烘箱電爐有限公司）;FYL-YS-50L恒溫箱（北京福意聯(lián)電器設(shè)備有限公司）。

1.2試藥? 丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：181120）購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;乙腈為色譜純;甲醇和磷酸為分析純;水為自制重蒸水;其他試劑均為分析純;加味逍遙散所需中藥材購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室廖月葵教授鑒定丹參本品為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）的干燥根及根莖。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件? 色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)性A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速：1.0 ml/min;柱溫：20 ℃;進(jìn)樣量：10 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于60000。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備? 丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液的制備：取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定后，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含丹參酮ⅡA 20 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備? 按處方量精密稱(chēng)取17味中藥材飲片，加入8倍量的85%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行3000 r/min離心? ? ? ?10 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3陰性供試品溶液的制備? 按處方量精密稱(chēng)取除丹參以外的16味中藥材飲片，加入8倍量的85%乙醇，加熱回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽濾，合并2次濾液，定容備用，取濾液2 ml進(jìn)行? ? ? 3000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1陰性干擾試驗(yàn)? 取“2.2”項(xiàng)下3種溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，分別測(cè)定其峰面積。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，分離度均>1.5，并且陰性供試品無(wú)干擾峰出現(xiàn)，理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算不低于60000。表明陰性樣品中其他組分對(duì)丹參酮ⅡA的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.3.2線(xiàn)性關(guān)系考察? 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μl進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，分別測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得其回歸方程。結(jié)果：丹參酮ⅡA回歸方程Y=466.96X+48.848，相關(guān)系數(shù)r=0.9991。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在4×10-3～2×10-2 μg，與峰面積呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3精密度考察? 精密的吸取同一對(duì)照品溶液? ? 10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其色譜峰的峰面積，計(jì)算。結(jié)果：丹參酮ⅡA RSD為2.74%，試驗(yàn)結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性考察? 按“2.2.2”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取10 μl進(jìn)樣分析，測(cè)定丹參酮ⅡA的含量，其RSD分別為0.19%，結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10μl進(jìn)樣分析，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定丹參酮ⅡA的峰面積，其RSD為0.10%。結(jié)果顯示該供試品具有穩(wěn)定性良好。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)? 精密量取已知丹參酮ⅡA含量的供試品溶液，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液制備方法制備濃度為0.2 mg/ml的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，分別精密加入濃度為0.2 mg/ml的丹參酮ⅡA對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0、8.0、12.0 ml，每個(gè)梯度平行兩份。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣的回收率，結(jié)果表明丹參酮ⅡA的平均回收率為97.36%，RSD%為1.38%（n=6）。

2.4樣品含量測(cè)定? 按處方量精密稱(chēng)取3份上述17味藥材飲片，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析后，計(jì)算丹參酮ⅡA的含量76.93 μg/g（n=3）。

3討論

丹參酮ⅡA具有顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、減慢心率、修復(fù)心肌、改善微循環(huán)及血液流變性、降低血脂、抗感染等作用[2]。丹參酮ⅡA是處方中主藥丹參的主要活性成分，其含量相對(duì)較高，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定不夠全面，通過(guò)實(shí)驗(yàn)用HPLC法測(cè)定該方中丹參酮ⅡA的含量。參照2015年版《中國(guó)藥典》一部丹參含量測(cè)定項(xiàng)下的提取方法，方中藥物用8倍量的85%乙醇提取，提取丹參中丹參酮ⅡA較為完全。經(jīng)試驗(yàn)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（75∶25，V/V）等度洗脫;流速：1.0 ml/min;柱溫：20℃;進(jìn)樣量：10 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm;測(cè)得結(jié)果比較理想，本法專(zhuān)屬性強(qiáng)，操作方便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性良好，可以用于加味逍遙散的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊超.加味逍遙散聯(lián)合經(jīng)皮射頻消融術(shù)治療21例原發(fā)性肝癌（肝郁脾虛型）的臨床療效觀(guān)察[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

收稿日期：2019-10-12;修回日期：2019-11-02

編輯/肖婷婷