Sirt1、炎癥因子與抗陰道結(jié)核治療的相關(guān)性研究

葉新春，蔣賢高，劉賽朵，程 芳，施伎蟬

(溫州市第六人民醫(yī)院傳染科，浙江 溫州 325000)

結(jié)核性陰道炎是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)入侵機體后引起的生殖器炎癥之一，是全身結(jié)核的一個表現(xiàn)，絕大多數(shù)陰道結(jié)核為繼發(fā)感染，繼發(fā)于肺、腹膜等臟器或泌尿系統(tǒng)等。結(jié)核分枝桿菌首先感染肺部，然后經(jīng)血液等多種途徑傳播至生殖部位等身體其他部位。人體在受到結(jié)核分枝桿菌侵入時，機體自身的免疫系統(tǒng)會分泌多種炎癥因子啟動和調(diào)控免疫反應(yīng)，包括促炎因子白細胞介素－6(IL-6)、干擾素－γ(IFN-γ)、TNF-α，以及抗炎因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF-β1)、IL-4等。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator1, Sirt1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶，能通過減少炎癥因子及減輕炎癥因子產(chǎn)生的病理損害來抑制炎癥反應(yīng)[1-2]。研究表明，結(jié)核分枝桿菌的感染能下調(diào)Stir1的表達水平，在結(jié)核分枝桿菌感染的動物模型中使用Sirt1激活劑可降低炎癥反應(yīng)，增強抗結(jié)核藥物的療效[3]。本研究通過對陰道結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后的Sirt1、炎癥因子表達水平的變化進行探究，探討抗結(jié)核治療后Sirt1、炎癥因子表達水平的變化與療效是否相關(guān)，希望對未來臨床抗結(jié)核治療的發(fā)展提供一定的幫助。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在2012年1月至2019年1月溫州市第六人民醫(yī)院收治的女性生殖器官結(jié)核患者中，選擇陰道結(jié)核患者27例為研究對象。納入標準：①經(jīng)病理活檢或手術(shù)確診為陰道結(jié)核；②病歷資料完整；③知情同意，能較好地配合隨訪和復(fù)診檢查。排除標準：①合并其他細菌感染、真菌感染，有自身免疫性疾病和長期使用免疫抑制劑的患者；②合并其他生殖系統(tǒng)感染結(jié)核的患者；③妊娠期或哺乳期女性。27例陰道結(jié)核患者年齡18～43歲，平均年齡(30.6±5.2)歲，入院后行陰道潰瘍活檢、分泌物涂片檢查，并對靜脈血進行結(jié)核分枝桿菌的聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢查。對所有研究對象進行至少6個月的抗結(jié)核治療，并在抗結(jié)核治療期間進行隨訪，每個月進行一次隨訪復(fù)查，記錄Sirt1、炎癥因子水平。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有患者給予常規(guī)抗結(jié)核治療，治療方案：口服異煙肼0.3g，每日1次；口服利福平0.45g，每日1次；口服吡嗪酰胺0.5g，每日3次，連續(xù)治療6個月。用藥期間密切監(jiān)測患者肝腎功能。

1.2.2 指標檢測

所有患者均于治療前和治療后1、2、4、6個月抽取晨空腹靜脈血5mL，離心處理(轉(zhuǎn)速為2 500r/min，離心時間為10min，離心半徑r = 15cm)，提取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢側(cè)血清中的IL-6、TNF-α、TGF-β1表達水平，IL-6試劑盒購買自上海康朗生物科技有限公司，TNF-α、TGF-β1試劑盒購買自深圳市科潤達生物工程有限公司。采用免疫印跡(Western Blot)法測定Sirt1水平：提取蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid, BCA)法對蛋白進行定量。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜。經(jīng)過漂洗和封閉后，以1∶1 000濃度加入一抗(兔抗人)Sirt1抗體孵育，內(nèi)參為1∶1 000濃度的人抗β-tubulin，再加入1∶4 000濃度的辣根過氧化物酶(hypothalamic regulatory peptides, HRP)標記的IgG二抗，按電化學發(fā)光法(electro- chemiluminescence assay, ECL)于化學發(fā)光成像儀上顯影，保存并觀察圖像，記錄平均灰度值即平均光密度(IOD)。

1.3 觀察指標

觀察治療前與治療6個月后的Sirt1(IOD值)、IL-6、TNF-α、TGF-β1變化情況。并分析分每位研究對象癥狀改善所需時間與Sirt1表達水平的關(guān)系，以及抗結(jié)核期治療期間Sirt1水平的改變。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析處理，其中計量資料以()表示，滿足正態(tài)性及方差齊性檢驗進行t 檢驗，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)法檢驗。設(shè)檢驗水準 α = 0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗結(jié)核治療前后Sirt1、炎癥因子表達水平變化的比較

與抗結(jié)核治療前相比，陰道結(jié)核患者抗結(jié)核治療6個月后Sirt1的表達水平有所升高(P ＜0.05)。炎癥因子IL-6、TNF-α、TGF-β1表達水平較治療前均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 治療前后Sirt1、炎癥因子表達水平的比較()Table1 Levels of expression of Sirt1 and inflammatory factors before and after the treatment()

表1 治療前后Sirt1、炎癥因子表達水平的比較()Table1 Levels of expression of Sirt1 and inflammatory factors before and after the treatment()

時間 Sirt1(IOD 值) IL-6(μg/mL) TNF-α(ng/mL) TGF-β1(μg/mL)治療前 7.35±1.38 214.73±60.65 318.14±71.66 37.68±6.13治療6 個月后 15.36±2.72 82.56±21.32 142.52±62.48 21.19±5.43 t 2.635 2.438 2.541 1.953 P 0.023 0.033 0.028 0.049

2.2 抗結(jié)核治療期間Sirt1 表達水平與炎癥因子表達水平變化的關(guān)系

抗結(jié)核治療期間Sirt1表達水平隨著治療的進行有所提高，炎癥因子IL-6、TNF-α、TGF-β1表達水平隨著治療的進行而下降。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Sirt1與炎癥因子IL-6、TNF-α、TGF-β1的表達水平呈負相關(guān)(r 分別為-0.857、 -0.978、-0.937，均P＜0.01)，見表2、圖1、圖2、圖3。

表2 抗結(jié)核治療期間Sirt1 表達水平與炎癥因子表達水平 變化的相關(guān)性分析Table 2 Correlation of Sirt1 expression level and inflammatory factor expression level during anti tuberculosis treatment

圖1 Sirt1 表達水平與IL-6 表達水平變化的關(guān)系Fig.1 Relationship between Sirt1 expression level and IL-6 expression level

圖2 Sirt1 表達水平與TNF-α 表達水平變化的關(guān)系Fig.3 Relationship between Sirt1 expression level and TNF-α expression level

圖3 Sirt1 表達水平與TGF-β1 表達水平變化的關(guān)系Fig.3 Relationship between Sirt1 expression level and TGF-β1 expression level

2.3 Sirt1 表達水平與陰道結(jié)核患者癥狀改善的關(guān)系

研究對象癥狀改善所需時間與治療期間Sirt1平均表達水平呈負相關(guān)(r = -0.945，P ＜0.01)，癥狀改善所需時間短的患者Sirt1表達較高，癥狀改善所需時間較長的患者Sirt1表達較低,見圖4。

圖4 Sirt1 表達水平與陰道結(jié)核患者癥狀改善所需時間的關(guān)系Fig.4 Relationship between Sirt1 expression level and time required for symptom improvement in vaginal tuberculosis patients

3 討論

3.1 結(jié)核分枝桿菌感染的全球現(xiàn)狀

據(jù)統(tǒng)計，全球結(jié)核分歧桿菌的感染率超過30%，其在入侵人體后首先在肺部感染，然后可隨著血液等多種傳播途徑轉(zhuǎn)移至腎、腹膜等其他器官造成繼發(fā)感染。結(jié)核性陰道炎是結(jié)核分枝桿菌入侵機體后引起的生殖器炎癥之一，是全身結(jié)核的一個表現(xiàn)，絕大多數(shù)陰道結(jié)核為繼發(fā)感染，繼發(fā)于肺、腹膜等臟器或泌尿系統(tǒng)等。女性生殖器官結(jié)核發(fā)病率為0.41%，而陰道、外陰結(jié)核占1%～2%[4-5]。盡管外陰、陰道結(jié)核的發(fā)病率遠低于其他身體器官，但臨床誤診率卻高達65%以上。陰道結(jié)核發(fā)病率低，其臨床癥狀與陰道炎、白塞病、阿米巴潰瘍、外陰癌等相似而極易混淆，從而被忽視和誤 診[6]，若不能及時、有效的對癥治療將給患者帶來極大的痛苦。

3.2 結(jié)核病的發(fā)生機制

結(jié)核分枝桿菌侵入人體后，機體自身免疫系統(tǒng)會迅速激活免疫細胞，大量分泌多種炎癥因子啟動和調(diào)控免疫反應(yīng)，包括促炎因子IL-6、IFN-γ、TNF-α，以及抗炎因子IL-10、TGF-β、IL-4等。隨著促炎因子分泌增多，抗炎因子的分泌也代償性增多，抗炎因子可部分抵消由促炎因子帶來的免疫介導(dǎo)的損害，具有保護性作用，但分泌過多會影響機體對結(jié)核分枝桿菌的免疫清除作用，可能會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌清除失敗而加重病情[7]。

3.3 Sirt1 分子的抗炎機制

Sirt1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶，已被證明與細胞衰老、抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥等多種細胞活動有關(guān)[8]，它能通過減少炎癥因子及減輕炎癥因子產(chǎn)生的病理損害來抑制炎癥反應(yīng)。研究表明，結(jié)核分枝桿菌的感染能下調(diào)Stir1的表達水平，在結(jié)核分枝桿菌感染的動物模型中使用Sirt1激活劑可改善結(jié)核病理癥狀、減少慢性炎癥、增強抗結(jié)核藥物的療效。本研究中，陰道結(jié)核患者在抗結(jié)核治療一段時間后Sirt1水平與入院時比較有所升高。目前已知核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是Sirt1的靶分子，且NF-κB能調(diào)控下游炎癥因子IL-6、TNF-α的表達。NF-κB是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫和炎癥的發(fā)生過程，可以啟動多種促炎因子的表達，炎癥因子也可以通過NF-κB通路被持續(xù)激活。NF-κB的P56亞基上第310位賴氨酸鹽的乙酰化是其活性的重要修飾，而Sirt1可使該處與乙酰化抑制NF-κB的活性[9-10]，進而抑制下游促炎因子IL-6、TNF-α的表達，發(fā)揮抑制炎癥的作用。本研究中，陰道結(jié)核患者在接受抗結(jié)核治療后炎癥癥狀顯著改善，Sirt1表達水平均有所升高，炎癥因子表達水平均顯著降低，但每位患者癥狀好轉(zhuǎn)的時間有所差別，其中，對抗結(jié)核治療藥物不耐受而出現(xiàn)肝腎功能損害也是影響抗結(jié)核治療療效的原因之一。這提示陰道結(jié)核患者抗結(jié)核的療效可能與Sirt1、炎癥因子的表達水平改變有關(guān)。而Sirt1蛋白表達水平與炎癥因子表達水平呈負相關(guān)，提示在結(jié)核感染的患者中，Sirt1也可以通過抑制炎癥因子發(fā)揮協(xié)同抗炎作用。抗結(jié)核治療療效不佳或易出現(xiàn)肝腎功能損害的患者，使用Sirt1激活劑可能會起到協(xié)同抑制炎癥的作用，增強常規(guī)抗結(jié)核治療方案的療效。

綜上所述，本研究通過對陰道結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后的Sirt1、炎癥因子表達水平的變化進行探究，發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核治療后Sirt1、炎癥因子表達水平的變化與療效具有一定的相關(guān)性，希望對未來臨床抗結(jié)核治療的發(fā)展提供一定的幫助。