超聲輔助提取黃櫨色素及其性能

任 云，尹芳芊，朱曉敏，王天星

（1.邯鄲學院化學化工與材料學院，河北邯鄲 056005；2.河北省雜環(huán)化合物重點實驗室，河北邯鄲 056005；3.邯鄲市有機小分子重點實驗室，河北邯鄲 056005）

黃櫨為漆樹科黃櫨屬植物，喬木或灌木［1］。黃櫨富含黃酮類化合物、單寧、多酚類物質及有機酸類等，還含有多種微量元素，例如鉀、鈉、鋁、鎂、硅、鈣、磷［2］，其中最主要的成分是黃酮類。至今，從黃櫨中共分離出18種黃酮類化合物，全棵不同地方的總黃酮量從大到小為根、枝莖、葉子［3］。除了黃酮類化合物外，周家永等［4］在研究黃櫨化學成分時發(fā)現，黃櫨的葉片、枝干和根莖中含有單寧及多酚類物質，且因黃櫨產地和季節(jié)不同，其各個部位的單寧量也有很大差異。Westenburg等［5］在黃櫨提取液中分離得到五沒食子酰葡萄糖。黃櫨嫩葉可以食用，葉片和枝干均可以入藥，在我國民間，有高血壓患者發(fā)現黃櫨可明顯降低血壓［6］。枝干部位可提取色素作為染料，朱莉娜等［7］對黃櫨色素提取及染色工藝進行了研究，得出超聲波提取法乙醇作為溶劑效果最好。利用黃櫨染液對真絲綢進行超聲波染色，染色織物有一定的色牢度，媒染可提高染色真絲綢的耐皂洗色牢度。隨著人們健康意識的提高，天然色素在日常生活中發(fā)揮著越來越重要的作用。在黃櫨中提取的天然色素可應用在食品、印染、化妝品等行業(yè)。天然色素提取通常采用溶劑提取法，近年來，超聲、微波等輔助手段可提高提取率，其中，超聲輔助通過超聲產生的攪拌和機械振動作用，破壞植物細胞的細胞壁以提高提取率，此過程沒有化學反應，但可以縮短浸提時間或降低提取溫度，能耗低、設備要求低［8-9］。

本文利用超聲輔助溶劑提取法提取黃櫨色素，并研究色素性能。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋁、無水硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅（分析純，天津市瑞金特化學品有限公司），氯化鉀、抗壞血酸、鐵氰化鉀（分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，新鄉(xiāng)市化學制劑廠）。

儀器：KQ-500DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），T6紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），WK-600A高速藥物粉碎機（青州市精誠機械有限公司），RE-52旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），FA2004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司），PHS-3E pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司），DHG-9140A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），800型離心沉淀器（濟南市醫(yī)療機械廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 超聲輔助提取黃櫨色素

將黃櫨枝干截成小段，在65℃烘至絕干后粉碎至40目。稱量黃櫨枝干粉末1 g于錐形瓶中，加入20 mL 95%的乙醇溶液，在40℃、超聲功率500 W的條件下提取30 min得到提取液。

1.3 實驗設計［10］

由單因素實驗考察各因素對黃櫨色素提取的影響，包括超聲功率、乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取溫度。

在單因素實驗的基礎上，選取主要影響因素料液比、乙醇體積分數和提取溫度，采用Box-Behnken設計響應面實驗。以黃櫨色素提取液吸光度為響應值，采用Design-Expert 8.0.6分析軟件得到二次回歸方程和誤差分析，以確定優(yōu)化工藝并進行驗證。

1.4 測試

紫外可見光譜：將提取液以4 000 r/min離心10 min，取上清液適當稀釋，在200～520 nm波長范圍內進行掃描。

吸光度：將色素提取液離心10 min，取上清液稀釋至0.1 g/L，在280 nm處測定。

提取率：準確稱量黃櫨枝干粉末20 g，按響應面法優(yōu)化工藝提取。將浸提液離心后，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏后，70℃干燥至恒重，稱量，計算黃櫨色素提取率：

金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響：將黃櫨色素粉配制成1 mg/mL溶液；配制0.05 mol/L的CuSO4、KCl、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、MgSO4溶液。取 1 mL色素溶液于25 mL容量瓶中，分別用8種金屬鹽溶液定容，在20℃下靜置12 h后進行紫外可見光譜掃描，與原色素溶液比較最大吸收波長和吸收峰的變化，分析金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響。

黃櫨色素總還原力：配制黃櫨色素和Vc溶液。取各溶液2.5 mL于25 mL錐形瓶中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL、1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，于50℃水浴保溫20 min，快速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1 g/L三氯化鐵溶液2.5 mL，搖勻，在20℃下靜置10 min，于700 nm處測定吸光度。

黃櫨色素清除DPPH自由基：配制黃櫨色素和Vc溶液，取各溶液5 mL，加入2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液5 mL，搖勻，在陰涼避光、20℃下靜置30 min，在517 nm處測定吸光度A1；取各溶液5 mL，加入無水乙醇5 mL，在517 nm處測定吸光度A2；取5 mL DPPH溶液，加入5 mL蒸餾水，在517 nm處測定吸光度A0。按下式計算DPPH自由基清除率：

2 結果與討論

2.1 紫外可見光譜

由圖1可以看出，黃櫨色素在280 nm處有最大吸收峰且穩(wěn)定存在，因此確定黃櫨色素的最大吸收波長為280 nm。

圖1 黃櫨色素的紫外可見吸收光譜

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲功率

由圖2可知，超聲輔助對提取過程有明顯影響。隨著超聲功率的增大，黃櫨色素提取液的吸光度近似線性增加，在達到最大功率500 W（由于設備硬件限制，最大超聲功率為500 W）時吸光度最大。在后續(xù)實驗過程中控制超聲功率為500 W。

圖2 超聲功率對色素提取的影響

2.2.2 提取時間

由圖3可知，隨著提取時間的延長，黃櫨色素的吸光度先增大后減小，在20 min時出現最大值（黃櫨色素提取率最高）。因為在提取時間較短時，超聲波產生的機械熱效應和空化效應可以使黃櫨色素被快速溶出；過度延長提取時間，可能會使色素重新被吸附，從而使吸光度減小。因此，后續(xù)實驗固定超聲提取時間為20 min。

圖3 提取時間對色素提取的影響

2.2.3 乙醇體積分數

由圖4可知，隨著乙醇體積分數的增加，黃櫨色素提取液的吸光度先增大后減小。在乙醇體積分數為60%時吸光度最大，說明此時色素提取率最高。由此可見，60%的乙醇溶液極性與黃櫨色素的極性相近，色素更容易被提取出來。

圖4 乙醇體積分數對色素提取的影響

2.2.4 料液比

一般情況下，隨提取溶劑比例的增大，提取率逐漸增大，至最大值后趨于平緩或略有波動，說明提取物已充分提取。由圖5可知，隨著提取溶劑比例增加，吸光度先增大后減小，在料液比為1∶20時吸光度最大，之后吸光度減小，可能為正常實驗波動，也可能是料液比為1∶20時，提取溶液體系的滲透壓最適合色素析出。

圖5 料液比對色素提取的影響

2.2.5 提取溫度

由圖6可知，隨著提取溫度的上升，色素吸光度先增大后減小，60℃時吸光度最大，溫度太高不利于色素提取，因為溫度太高，色素中的黃酮類化合物穩(wěn)定性降低、結構被破壞，吸光度下降。因此，適宜的色素提取溫度為60℃。

圖6 提取溫度對色素提取的影響

綜上所述，超聲功率與色素提取率近似成線性正相關，提取時間在20 min后，色素提取率可視為進入平臺期，因此，兩因素不作為響應面優(yōu)化因素。遂以色素吸光度為響應值，對料液比、乙醇體積分數和提取溫度進行響應面法優(yōu)化實驗。

2.3 響應面實驗

2.3.1 建立二次回歸方程及誤差分析

對表1中的數據進行回歸擬合得到二次回歸方程為：吸光度=0.350+0.027A-9.875×10-3B+0.023C+1.000×10-3AB-0.011AC-0.011BC-0.012A2-0.018B2-0.055C2。

表1 響應面實驗結果

通過ANOVA進行回歸方程誤差分析，結果如表2所示。

表2 響應面誤差分析結果

由表2可知，該方程模型高度顯著（P小于0.01），失擬誤差不顯著（P大于0.05）。CV值越小模型置信度越高，相關系數R2和Radj2越接近1，模型相關性越好。該模型的CV=3.59%、R2=0.969 5、Radj2=0.930 3。二次回歸方程對實驗的擬合程度較高，說明色素提取液響應值96.95%的影響來自于所考察的3因素，實驗模型可以合理模擬實際實驗，可以預測各因素、各水平下色素提取液的吸光度。另外，3因素中A、C、C2對色素提取液吸光度的影響高度顯著；B、B2影響顯著；AB、AC、BC、A2影響不顯著，各因素影響從大到小依次為乙醇體積分數、提取溫度、料液比。

2.3.2 各影響因素的交互作用

觀察圖7～9的響應面均比較平緩，對應等高線接近圓形，結合表2中3組交互作用P均大于0.05，表明3組交互作用均不顯著。

由圖7、圖9可見，兩圖中三維響應面曲線沿料液比軸方向吸光度逐漸增加并趨于平緩，對應的三維響應面在底面的投影等高線沿料液比軸方向亦表現為吸光度逐漸增大并趨于平緩，沒有起伏。說明提取液吸光度隨提取液用量的增加逐漸增大，色素提取率增大；料液比1∶20附近為提取率最大點，色素已被充分提取，繼續(xù)增加提取液用量，色素提取率不會提高。進而說明圖5中吸光度在最大值后出現降低為正常實驗波動。

圖7 乙醇體積分數和料液比響應面曲線圖

圖8 乙醇體積分數和提取溫度響應面曲線圖

圖9 料液比和提取溫度響應面曲線圖

根據響應面優(yōu)化實驗得出優(yōu)化提取工藝為：乙醇體積分數68.03%、料液比1.00∶18.83、提取溫度61.48℃。在此工藝條件下，20 g黃櫨枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率為7.4%。

2.4 色素性能

2.4.1 穩(wěn)定性

由表3可知，Na+、K+、Ca2+、Mg2+對黃櫨色素性能的影響極小，相對于原色素溶液的吸光度和最大吸收波長均無明顯變化，故此4種金屬離子對黃櫨色素的穩(wěn)定性無影響；Al3+使得黃櫨色素的最大吸收波長紅移了6 nm，且280、286 nm處的吸光度均有增加；Zn2+并未改變黃櫨色素的最大吸收波長，但出現了黃色絮狀沉淀，對黃櫨色素穩(wěn)定性有不利影響；Fe3+和Cu2+分別產生黑綠色沉淀和深綠色沉淀，故Fe3+和Cu2+對黃櫨色素的穩(wěn)定性有極不利的影響。綜上所述，黃櫨色素溶液可以接觸 Na+、K+、Ca2+、Mg2+，根據實際情況可適當接觸 Al3+，應避免接觸 Zn2+、Fe3+和 Cu2+。

表3 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

2.4.2 總還原力

黃櫨色素和Vc通過自身的還原作用能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵，亞鐵氰化鉀與FeCl3反應，生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍，且吸光度越高，待測物的還原力越強。由圖10可知，黃櫨色素總還原力在所測質量濃度范圍內大于Vc，具有較強的還原力。

圖10 總還原力實驗結果

2.4.3 DPPH自由基清除能力

黃櫨色素自由基清除能力見圖11。

圖11 黃櫨色素自由基清除能力

由圖11可知，黃櫨色素DPPH自由基清除率隨色素質量濃度的升高而增大，但清除能力略低于Vc。反應后，DPPH迅速褪色為淡黃色透明溶液，且不同質量濃度的黃櫨色素反應后溶液的吸光度有明顯的梯度變化。在質量濃度達到0.18 mg/mL時，清除率可達92.3%，表明黃櫨色素的自由基清除能力良好。

3 結論

（1）超聲輔助溶劑提取工藝可較好地提取黃櫨枝干中的色素。單因素實驗結果表明：超聲功率與提取率成線性關系；提取時間在20 min后可達平臺期。響應面優(yōu)化實驗確定優(yōu)化工藝條件為：乙醇體積分數68.03%、提取溫度61.48℃、料液比1.00∶18.83。優(yōu)化浸提條件下20 g黃櫨枝干粉末可提取色素粉1.48 g，提取率為7.4%。

（2）Na+、K+、Ca2+、Mg2+對色素穩(wěn)定性的影響很小；Al3+使黃櫨色素的最大吸收波長紅移了6 nm，吸光度增加；Zn2+、Fe3+和 Cu2+使色素產生沉淀。

（3）黃櫨色素總還原力比Vc強，DPPH自由基清除能力比Vc弱，但在質量濃度達到0.18 mg/mL時，清除率可達92.3%。