線粒體調控NLRP3炎性復合體活化的機制及中藥有效成分干預作用

南鳳尾 景光嬋 張孟仁

固有免疫應答是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線，能夠啟動和參與適應性免疫應答。固有免疫細胞表面存在模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，PRRs感受到病原體入侵或內源性損傷時，可與病原微生物表面的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或內源性損傷來源的損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)發生相對特異性的結合，啟動即時免疫效應。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors, NLR]是存在胞質中的一類重要的PRR，NLR家族中最大的亞家族是含有NACHT-LRR-PYD[NACHT,LRR-and pyrin-domain (PYD)-containing protein, NALP]或稱含NLR家族熱蛋白結構域蛋白(NLR family pyrin domain containing protein, NLRP)的受體家族。大部分NLRP在識別胞質中不同的PAMP或DAMP后，能夠形成炎性復合體。炎性復合體也稱炎性小體，是由胞質中的多種PRR參與組裝的一類多蛋白復合物，目前已經發現的主要有4種，即NLRP1炎性復合體、NLRP3炎性復合體、IPAF(或稱NLRC3)炎性復合體和AIM2炎性復合體。其中，NLRP3炎性復合體由于可被多種結構不同的配體激活，進而參與到痛風、腸炎、糖尿病、阿爾茲海默病、動脈粥樣硬化、感染和腫瘤等多種疾病的發生過程，故而成為目前關注最多、研究最為深入的一類炎性復合體[1]。

一、NLRP3炎性復合體的組成和活化

NLRP3炎性復合體由3部分構成(圖1)：(1)NLRP3蛋白：由3個結構域構成：①C端富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats, LRRs)，負責探測和識別PAMPs/DAMPs；②中央是核酸寡聚化結構域(nucleotide-binding and oligomerization domain, NOD)，也稱為NACHT結構域，負責參與NLR的寡聚體化和活化；③熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)，位于N端，負責結合接頭分子和效應蛋白。(2)凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-lilke protein containing a caspase recruitment domain, ASC)，為接頭蛋白。ASC又分為：①caspase募集結構域(caspase-recruitment domain，CARD)，可連接caspase-1前體蛋白；②PYD結構域，以連接NLRP3的同源結構域PYD。(3)caspase-1前體蛋白，為效應蛋白。當NLRP3識別到PAMPs/DAMPs時，發生寡聚化，并與ASC結合，招募caspase-1前體蛋白，形成NLRP3炎性復合體，進而激活caspase-1，caspase-1屬于促炎蛋白酶，活化的caspase-1通過剪切的方式活化白細胞介素1β前體(pro-interleukin 1β, pro-IL-1β)和白細胞介素IL-18前體(pro-interleukin 18, pro-IL-18)，從而釋放大量成熟的IL-1β和IL-18。近年來的研究表明，caspase-1還可介導細胞焦亡。細胞焦亡是一種致炎性的程序性的細胞死亡，可釋放出大量的炎性物質，誘發嚴重的炎性反應[1]。目前研究者認為NLRP3炎性復合體的活化需要兩條信號通路依次激活：(1)啟動步驟：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和其配體相互作用，造成NLRP3 和IL-1β前體被核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)轉錄，以完成NLRP3炎性復合體活化的準備過程。(2)活化步驟：在持續的PAMPs或DAMPs刺激下，NLRP3通過NACHT結構域發生寡聚化，進而激活NLRP3炎性復合體組裝，最終活化效應蛋白caspase-1。此外，另一假說認為，持續的鈣離子內流可刺激胞內鈣離子升高，環腺甘酸AMP(cyclic AMP，cAMP)降低，介導NLRP3炎性復合體活化[2]。

圖1 NLRP3炎性復合體結構示意圖PAMPs. 病原體相關分子模式；DAMPs. 損傷相關分子模式； LRRs. 模式識別受體; NOD.NOD樣受體蛋白 3； PYD. 熱蛋白結構域； CARD.caspase募集結構域

二、線粒體在NLRP3炎性復合體活化中的作用

長期以來，線粒體一直被視為能量工廠，可提供細胞生命活動所需的能量。研究發現線粒體還是固有免疫反應最基本的信號平臺之一，在NLRP3炎性復合體的活化過程中發揮著重要的作用[3](圖1)。

1.NLRP3炎性復合體活化時NLRP3的線粒體定位：靜息狀態下NLRP3位于內質網膜，受到NLRP3炎性復合體激活劑作用后，NLRP3和其配體ASC聚集到細胞核周圍，分布于線粒體外膜與內質網膜形成的偶聯部位。而且已有研究證明，線粒體相關適配蛋白(mitochondria-associated adaptor protein, MAVS)不僅可介導NLRP3募集到線粒體，而且在NLRP3促進IL-1β產生的過程中也發揮功能，是NLRP3 炎性復合體發揮其最佳活性的關鍵因素[4]。此外，線粒體特有的心磷脂也是NLRP3炎性復合體活化必須的因子，受到利奈唑胺刺激后，NLRP3直接與心磷脂結合，而后NLRP3炎性復合體活化；反之，心磷脂合成受阻則會造成NLRP3炎性復合體活化受到干擾[5]。

2.ROS在NLRP3炎性復合體活化中的作用：機體受到感染時，天然免疫細胞(如巨噬細胞和中性粒細胞)就會發起防御，并產生活性氧(reactive oxygen, ROS)，ROS的主要來源是線粒體。損傷的線粒體釋放線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和線粒體ROS(mitochondrial ROS，mtROS)，這被認為是內源性損傷信號。在尼日利亞菌素、尿酸和ATP刺激引起mtROS水平升高的細胞中，mtROS清除劑可明顯減輕NLRP3炎性復合體的活化。同樣地，在臭氧誘導的小鼠慢性阻塞性肺氣腫模型中，mtROS清除劑也可有效抑制肺組織中NLRP3炎性復合體的表達，說明mtROS是NLRP3炎性復合體的上游信號[6]。在尼日利亞菌素感染的細胞內，氧化的mtDNA可特異性結合NLRP3，介導NLRP3炎性復合體活化，從而導致IL-1β釋放增多[7]。而且， mtROS釋放后，線粒體電子傳遞鏈破壞，進一步引起NLRP3炎性復合體活化[8]。大部分研究支持ROS介導了NLRP3炎性復合體組裝和活化，其作用機制有待于進一步明確。然而，Bauernfeind等的研究卻表明，ROS僅僅參與了其組件NLRP3的引發階段，與NLRP3炎性復合體的活化無關。此外，以利奈唑胺、流感病毒、腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)處理巨噬細胞，均能激活NLRP3炎性復合體，且不需要ROS的參與[7]。

3.鈣信號調節NLRP3炎性復合體的活化：線粒體內的鈣離子濃度對于ATP合成、線粒體通透性轉換孔的開放及細胞質內鈣信號的調節具有重要影響。線粒體內鈣離子水平過高會導致線粒體功能障礙，進而促進NLRP3炎性復合體的活化。胞外鈣離子濃度升高可刺激G蛋白偶聯鈣敏感受體，然后活化NLRP3炎性復合體和caspase-1。六型分泌系統(T6SS)的效應分子EvpP能夠通過降低細胞內鈣離子水平，抑制MAPK-JNK通路進而抑制NLRP3炎性復合體的激活[9]。線粒體通透性轉換孔持續開放是線粒體損傷的另一特征。有研究者提出持續的鈣離子內流和內質網的貯存鈣釋放，可刺激線粒體鈣離子負荷增多和線粒體穩態破壞，引起mtROS水平升高和線粒體通透性增加。這種模型也被用來解釋鈣離子信號在NLRP3炎性復合體活化中的作用[10]。

4.線粒體分裂蛋白和融合蛋白調節NLRP3炎性小體活化：正常情況下，哺乳動物的線粒體通過不斷地分裂、融合維持其形態結構完整，保障正常功能。線粒體動員相關蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)和線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fisl)通過相互作用來促進線粒體的分裂。線粒體融合蛋白1(Mitofusin 1，Mfn1)和線粒體融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn2)是線粒體外膜相關蛋白，是線粒體融合的關鍵蛋白。在DRP1基因敲除小鼠的巨噬細胞，線粒體異常分裂導致NLRP3依賴的caspase-1激活和IL-1β分泌增加。其機制可能是增強細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號，介導NLRP3分布于線粒體，從而促進NLRP3炎性子體的組裝[11]。

水皰性口腔炎病毒引起絲氨酸-蘇氨酸激酶RIP1和RIP3激活時，RIP1和RIP3可刺激DRP1，引起線粒體異常分裂，造成胞質內ROS水平升高，導致NLRP3炎性復合體活化[12]。科羅索酸可通過促使內皮細胞DRP1 Ser637位點發生磷酸化，阻止氧化應激造成的線粒體分裂，進而阻斷NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2)信號，抑制NLRP3炎性復合體的活化[13]。在RNA病毒感染的細胞中，Mfn2可以和NLRP3 相互作用，誘導NLRP3炎性復合體活化。更直接的證據顯示，以流感病毒或EMCV處理Mfn2基因敲除的細胞后，細胞中caspase-1以及IL-1β表達水平顯著降低[14]。以上表明， DRP1功能穩定可維持線粒體分裂正常，抑制NLRP3炎性復合體的活化；而Mfn2則可促進NLRP3炎性復合體的活化，導致炎性反應。

5.線粒體自噬抑制NLRP3炎性復合體的活化：細胞自噬是細胞通過溶酶體降解變性的蛋白質和功能失調的細胞器的過程，在細胞保持動態平衡過程中起關鍵作用。目前，將通過細胞自噬降解線粒體的途徑稱為線粒體自噬，主要是指在ROS增多、營養缺乏和細胞衰老等刺激下，線粒體發生去極化損傷，損傷的線粒體被特異性包裹入自噬體，并與溶酶體融合，從而降解損傷的線粒體。線粒體自噬可防止NLRP3炎性復合體過度活化造成的炎性反應。在沒有炎性復合體激活物的情況下，1-磷脂酰肌醇3-激酶(1-phosphoinosmde-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K)抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)能夠抑制自噬，并引起mtROS增加，造成NLRP3依賴的IL-1β分泌的增多[15]。在結核桿菌感染的細胞中，3-MA同樣可以可抑制自噬體形成，從而促進IL-1β分泌。與此一致，自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈-3(autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain-3，LC3)基因敲除小鼠骨髓來源的巨噬細胞中，線粒體損傷增加以及mtROS水平升高，caspase-1活性增強。這一現象也出現在膜突蛋白樣Bcl-2作用蛋白1(moesin-like BCL2-interacting protein，Beclin1)基因敲除的小鼠。而且，自噬相關基因16L1(autophagy gene 16L1，Atg16L1)敲除后，小鼠NLRP3炎性復合體活化增多，對葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎更為敏感[15]。此外，sestrin(SESN2)是一種應激誘導蛋白，可通過誘導自噬清除損傷的線粒體，進而抑制NLRP3炎性復合體的活化[16]。作為炎癥的主要激活因子，NF-κB也能夠促進自噬受體蛋白p62/SQSTM1積累，介導線粒體自噬，促進線粒體清除，抑制NLRP3炎性復合體活化[17]。這些研究表明線粒體自噬可以抑制NLRP3炎性復合體的活化。

6.其他：腺嘌呤核苷酸轉運體1(adenine nucleotide translocator 1，ANT1)是線粒體膜通透性轉運的中心分子。在NLRP3炎性復合體刺激物的作用下，Src同源-2結構域蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)轉位到線粒體，與ANT1結合并使得ANT1去磷酸化。這一機制能夠阻止線粒體膜電位的降低，并抑制mtDNA和mtROS的釋放，因此可以阻止NLRP3炎性復合體的過度活化[18]。雙磷脂酰甘油是線粒體內膜上的一種特異性磷脂，在線粒體功能發生障礙時，雙磷脂酰甘油可作為一種PAMP被NLRP3識別，進而激活NLRP3炎性復合體。而且，通過siRNA抑制雙磷脂酰甘油合酶后，caspase-1的激活受到明顯抑制，這表明雙磷脂酰甘油可促進NLRP3炎性復合體活化，但具體機制尚未完全闡明[7]。

三、中藥活性成分的干預作用

圖2 線粒體調控NLRP3炎性復合體活化示意圖MAVs. 線粒體相關適配蛋白；Drp1. 線粒體動員相關蛋白1； Mfn2. 線粒體融合蛋白2；ANT1. 腺嘌呤核苷酸轉運體1；mtDNA. 線粒體DNA；mtROS.線粒體ROS；pro-IL-1β.白細胞介素1β前體；pro-IL-18.白細胞介素IL-18前體；IL-1β. 白細胞介素1β； IL-18. 白細胞介素IL-18

許多中藥活性成分能夠通過調節線粒體功能抑制多種細胞模型中NLRP3炎性復合體的活化。這些中藥活性成分能夠抑制ROS過度產生，減輕線粒體損傷，激活自噬，進而抑制NLRP3炎性復合體，減少IL-1β和caspase-1的釋放，減輕病理條件下的炎性反應，發揮對細胞的保護作用[17-33]。目前的研究大多限于對藥效的評價，而對具體的調控機制研究不夠深入。能夠通過線粒體調控NLRP3炎性復合體的活化的中藥活性成分詳見表1，其中以黃酮類最多。黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，這可能是其發揮作用的基礎之一。從這些成分所屬的中藥分析，清熱藥最多，其次是補虛藥。現代藥理學研究表明，清熱藥具有抗感染、抗炎和影響機體免疫功能的作用，補虛藥也具有調節機體免疫功能、增強內分泌功能和抗衰老等活性作用。這兩類藥可能存在更多抑制NLRP3炎性復合體活化的成分，值得深入挖掘。

四、展 望

作為天然免疫的重要成員之一，NLRP3炎性復合體活化對于保護細胞免受病原體損傷十分重要，但其過度活化可能會引發炎性反應，造成組織損傷和器官衰竭。通過影響NLRP3及其配體的線粒體定位，以及線粒體自噬、分裂和融合及通透性等多個環節，線粒體在NLRP3炎性復合體的組裝和活化中發揮關鍵作用。在不同的病理條件及活化刺激條件下，線粒體對NLRP3炎性復合體活化的調節作用也有差異。線粒體損傷并釋放損傷信號以及線粒體調節自身穩態的過程，貫穿于線粒體對NLRP3炎性復合體的調控之中。線粒體的膜蛋白能夠與NLRP3結合，在NLRP3炎性復合體組裝階段起重要作用；同時這些蛋白也可以影響線粒體分裂和融合，從而調節NLRP3炎性復合體的活化。線粒體自噬可抑制NLRP3過度活化造成的損傷，對機體起到保護作用。

表1 能夠通過調節線粒體功能抑制NLRP3炎性復合體活化的中藥活性成分及作用機制

綜上所述，線粒體結構及功能的正常對于抑制NLRP3炎性復合體過度活化十分關鍵，維持線粒體穩態可能是調節NLRP3炎性復合體上游信號的重要策略。深入研究NLRP3炎性復合體的線粒體調控機制，有助于更好地認識天然免疫和炎性疾病的生理病理過程，能夠為臨床治療提供新靶點。中藥有效成分在抑制NLRP3炎性復合體活化方面的研究取得了一定進展，今后尋找更多能調節NLRP3炎性復合體的中藥有效成分并進一步研究其作用機制，有望發現理想的NLRP3炎性復合體抑制劑。