乳康飲含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力的作用

李湘奇 魏昌然 張 萌 王 瑩 郭桂麗

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來嚴重威脅女性身心健康，目前每年全球約有170萬女性被診斷為乳腺癌，發生率呈直線上升趨勢，發病的年齡亦漸趨年輕化[1]。腫瘤臨床及基礎研究認為，乳腺癌作為全身性疾病已被業內醫學研究者共識，以手術為主的綜合性治療原則，可最大限度改善部分患者的預后，使無病生存期延長，這是不爭的事實，但任何治療均不能完全阻止乳腺癌的復發和轉移，從而導致乳腺癌患者的死亡。有研究資料顯示，每年約有高達40%的乳腺癌患者出現復發轉移，意味著在我國每年近10萬乳腺癌病例出現新的復發轉移，轉移性乳腺癌預后很差，治療棘手，平均存活時間只有2年，因此控制乳腺癌的復方轉移是臨床研究亟待解決的問題[2]。

中醫藥治療乳腺癌已經有了比較系統的理念，研究表明中醫藥可以對機體整體進行干預，通過促進機體內環境的優化和改善，降低乳腺癌的復發與轉移率，從而進一步使病死率降低，提高患者的整體生存質量[3]。中藥治療乳腺癌的優勢表現為改變癌毒特性，最大限度的殺滅癌毒，并整體調控內環境，提高機體的抗癌能力，從病理上改善瘀滯狀態，阻斷轉移途徑。基本治療理念是以辨證論治為基礎，扶正培本為主，祛邪抗癌為輔，結合患者的疾病特征綜合治療，扶正培本的理念貫穿于乳腺癌治療的全程。作為乳腺癌綜合治療的重要組成部分，中醫藥研究已經取得了令人矚目的成績。事實上乳腺癌轉移是一個復雜的生物過程，由多個基因參與和調控，涉及到癌細胞的脫落、遷移與轉移灶的生長，其轉移的潛能與基因在不同患病個體腫瘤細胞內表達程度密切相關[4]。

已有研究證實，腫瘤的轉移與腫瘤細胞的上皮間質轉化，遷移和侵襲能力增強有密切的關聯，中藥及其有效成分抑制腫瘤細胞遷移侵襲轉移的作用機制主要包括調節對腫瘤細胞的殺傷作用，抑制腫瘤遷移、侵襲、轉移相關基因的表達，抑制腫瘤血管生成，影響腫瘤細胞的黏附運動，調節體內免疫微環境[5]。乳腺癌(腫瘤)本身并不致死，癌細胞轉移，并引起其他器官的病變才是致命性的[6]。因此以各種手段控制乳腺癌細胞的遷移，降低其惡性侵襲能力，將是阻斷或逆轉乳腺癌轉移的關鍵之一。筆者前期的研究發現，乳康飲以疏肝健脾為基本治法組方，對乳腺癌及其淋巴轉移有顯著的治療作用，乳康飲由黃芪、茯苓、青皮、柴胡、莪術、薏苡仁組成，基礎研究按照功效拆方后，對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖有顯著的抑制作用，各組方部分均能促進乳腺癌細胞的凋亡[7]。在此研究的基礎上，繼續探討乳康飲及拆方動物含藥血清對乳腺癌細胞侵襲和遷移的抑制作用，能夠進一步闡明乳康飲阻斷乳腺癌轉移的作用機制，為復方中藥治療乳腺癌抑制淋巴轉移提供支持依據。

材料與方法

1.實驗動物及細胞:實驗動物：SD大鼠，雌性，3月齡，體質量250～300g，SPF級，購于山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(魯) 20140007。人乳腺癌MDA-MB-231細胞株，購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2.藥物及試劑:乳康飲由黃芪、茯苓、薏苡仁、柴胡、青皮、莪術組成，乳康飲按照功效拆方為疏肝理氣組(柴胡、青皮、莪術)，益氣健脾組(黃芪、茯苓、薏苡仁)，將乳康飲及拆方組采用水提醇沉法制劑方法制成口服液劑型，各組藥物終濃度分別為1.08g/ml、0.75g/ml、0.33g/ml。DMEM培養液(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，Transwell小室(美國BD公司FALCON REF353097)，DAPI(北京索萊寶科技有限公司C0065)。

3.儀器:超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司SW-CJ-1D 型)，CO2培養箱(Thermo 371型)，熒光倒置顯微鏡(Ti-s Nikon儀器有限公司)，臺式高速離心機(鹽城市凱特實驗儀器有限公司TG16G)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司705型)。

4.含藥血清的制備及鑒定:SPF級SD大鼠20只，隨機分為4組，每組5只，分別為空白對照組、乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組，每組動物適應環境后，參照《抗癌藥物研究與實驗技術》附表“人和動物間按體表面積折算表”進行換算，計算出人鼠的等效灌胃劑量，分別予以0.9%NaCl溶液、乳康飲、益氣健脾組、疏肝理氣組藥液，按人鼠的等效劑量灌胃，灌胃液體量均為0.4毫升/(天·只)，連續給藥15天，末次給藥2h后處死取血，靜置后高速離心，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌，留取各組含藥血清，置于-80℃分裝凍存備用。采用高效液相法鑒定乳康飲制劑及拆方組含藥血清中各藥物入血成分：選取青皮的主要成分橙皮苷為代表藥品，吸取乳康飲制劑供試品溶液、橙皮苷對照品溶液10μl及含藥血清、空白血清供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。經3次以上重復實驗后，讀取結果顯示，乳康飲含藥血清中出現了與橙皮苷對照品、乳康飲制劑原液藥物相同位置的波峰(A)，通過對照品譜圖比對，鑒定為橙皮苷，結果見圖1。組方中其他藥物鑒定同上。

圖1 空白血清、含藥血清、對照品及乳康飲制劑高效液相圖譜比較

5.細胞培養:人乳腺癌MDA-MB-231細胞株，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，以37℃、5% CO2條件下培養，待細胞貼壁生長，長滿細胞單層后，用胰酶(1∶1) 進行消化傳代，選取對數生長期的細胞供試驗用。按照不同分組分別用20%中藥含藥血清和空白大鼠血清(空白對照組)繼續培養。

6.劃痕實驗和Transwell侵襲實驗:(1)劃痕實驗：將處于對數生長期的MDA-MB-231乳腺癌細胞經胰酶消化后調整細胞密度為3×105個/毫升，接種于24孔板，每孔500μl細胞懸液，37℃、5% CO2培養箱進行培養，細胞貼壁后，細胞的密度達90%以上時，用10μl槍頭垂直于細胞劃痕，PBS沖洗3次，分別加入含20%乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組含藥血清的培養基500μl后，在5% CO2培養箱中再培養48h，采用倒置顯微鏡觀察細胞遷移及劃痕寬度的變化，分別于劃痕后0h和48h兩個時點，倒置顯微鏡下拍照，觀察劃痕的愈合狀態。由于20%乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組含藥血清能夠抑制細胞的增殖，誘導細胞的凋亡，但在干預24h內不明顯，所以觀察時點選擇0h和48h[7]。(2)Transwell侵襲實驗：調整細胞密度為3×105個/毫升，上室加入不含血清的細胞懸液200μl，下室加入20%各組含藥血清的完全培養基500μl，在5% CO2培養箱中培養48h后，以適量PBS將Transwell小室清洗潔凈，去除上室的細胞和基質膠，4%多聚甲醛固定25min，DAPI染色20min，熒光顯微鏡下拍照，倒置顯微鏡觀察5個視野，記數細胞后取平均值。

結 果

1.乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響:檢測乳康飲及各拆方組含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的作用，進行了劃痕實驗，結果發現，乳康飲及拆方組含藥血清對MDA-MB-231細胞遷移均有不同程度的影響，在乳康飲及拆方含藥血清作用48h后，各種細胞劃痕均有不同程度的愈合，空白血清對照組愈合最佳，乳康飲組及兩組拆方血清均能抑制細胞的劃痕愈合，細胞遷移抑制率與空白血清對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，乳康飲全方組抑制細胞劃痕愈合效果明顯優于疏肝理氣、益氣健脾拆方組 (P均<0.05)。結果見圖2、圖3、表1。

圖2 乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力的作用(×40)

圖3 乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲及遷移抑制率

2.乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲的影響：Transwell侵襲實驗結果顯示，乳康飲及各拆方組含藥血清均能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的侵襲，經過乳康飲及其拆方含藥血清處理MDA-MB-231細胞后， 細胞體外侵襲能力明顯降低，侵襲穿過Transwell小室的細胞每個視野平均數與空白對照組比較，顯著降低(P<0.01)，乳康飲組效果最為明顯，優于益氣健脾拆方組 (P<0.05)，但與疏肝理氣組比較，差異無統計學意義。結果見表1、圖3、圖4。

表1 乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲能力的影響

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與乳康飲組比較，#P<0.05

圖4 乳康飲及拆方含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響(×100)A.空白對照組；B.乳康飲組；C.疏肝理氣組；D.益氣健脾組

討 論

乳腺癌的早期診斷、早期治療及適時的預后判斷是臨床關注的熱點問題之一，隨著分子生物學及免疫治療學研究的發展，已認識到乳腺癌發生、發展本質上是由多種基因變化引起的，細胞內原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是誘發乳腺癌的主要原因。由于遠處轉移導致了乳腺癌治療的失敗和患者死亡，乳腺癌轉移是由多種基因參與和調控的復雜的生物學行為，各種基因在不同患病個體腫瘤細胞內表達差異，決定了不同患者或不同亞型腫瘤轉移的潛能，這種差異嚴重影響了乳腺癌的治療效果和預后。

乳腺癌的治療除根治性手術外，化療、放療、內分泌治療及生物靶向治療等方法密切配合，能夠顯著延長患者的生存期，但藥物治療中的毒性不良反應及相關并發癥，會嚴重地影響到患者的生存質量。研究證實，中醫藥在緩解乳腺癌手術的并發癥及減輕放、化療及內分泌治療、生物靶向藥物的毒性不良反應，降低復發轉移，提高患者的綜合治療效果及生活質量方面有著獨特的優勢[8]。

中醫藥的文獻雖無“乳腺癌”的病名，但可見 “乳巖”、“乳疳”等類似記載，對乳腺癌病因病機認識多責之于肝脾二經，如《格致余論》指出：“憂怒抑郁，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核”。《醫宗金鑒》論乳巖：“……皆緣抑郁不舒，或性急多怒，傷損肝脾所致”。認為乳腺癌的發生、發展與肝脾二傷、邪毒留滯有關。有研究者綜合整理分析了中醫藥抗乳腺癌術后復發和轉移方面的臨床研究成果，系統歸納總結了諸多醫家有關乳腺癌治療后復發和轉移的病因病機，認為導致患者乳腺癌復發轉移的決定因素是機體正氣虛損，歸結為脾腎虧虛、沖任失調為乳腺癌發病之本，氣機不暢、瘀血痰濁、熱毒內蘊等為發病之標[9]。皆因正氣虛弱，外邪乘虛內侵，內外之邪阻塞乳絡，而致氣血失和，運行不暢；或情志不遂，內傷臟腑，肝氣郁結；或飲食不節，脾胃受損，痰濕內傷；臟腑功能失調，導致氣機郁結、瘀血停留、痰濁內生，又進一步損傷正氣。至于乳腺癌轉移的病機還沒有形成理論體系，現代中醫學研究也不充分，有研究者通過總結臨床經驗，闡述了“正氣虧虛，余毒未盡”的學術觀點，認為乳腺癌復發轉移由“伏邪”、“余毒”而引發，提出了“余毒旁竄”核心病機理論[10]。

有研究認為“痰毒瘀結、癌毒內生”是乳腺癌發生、發展的核心病機，而“從化”現象的存在，是導致乳腺癌術后復發轉移的主要原因[11]。由此可見，乳腺癌的復發轉移是因虛致實 (癌)、因實 (癌)更虛、虛實夾雜的過程；正虛邪盛，邪毒走竄旁流，則導致乳腺癌的復發轉移。根據其病機變化，臨床治療常選用疏肝理氣、化痰散結、活血祛瘀、清熱解毒諸治法，祛除邪毒以抗癌；以健脾補腎、益氣養血、調補沖任而扶正固本，扶正治法貫穿整個治療過程。扶正藥既增強機體的抗癌能力，又為袪邪抗癌創造必要條件。因此，扶正固本法對于協助乳腺癌手術、放療、化療、內分泌治療以及生物靶向治療等尤其重要，能起到增效減毒，改善患者的自覺癥狀，緩解穩定病情，延長生存期，提高生存質量等作用。臨床采用辨病辨證互參，扶正與祛邪結合，虛實主次分清，邪正盛衰慎重權衡，做到“扶正以祛邪”，“祛邪以扶正”，扶正祛邪并施。所以中醫藥治療乳腺癌從整體觀念出發，調整平衡機體陰陽、氣血、臟腑功能，在乳腺癌的臨床治療具體應用中進一步系統地觀察，并客觀評價，奠定中醫藥治療乳腺癌的地位。

筆者從乳腺癌的病因病機入手，采用疏肝健脾為主的治則治法，結合中藥藥理組方乳康飲，全方以黃芪、茯苓益氣健脾，扶正固本，柴胡、青皮疏肝解郁，調達肝氣，莪術、薏苡仁化痰軟堅、活血化瘀，以祛邪治標。前期乳康飲及其拆方的研究結果，全方及各拆方組的含藥血清均能夠顯著抑制三陰性乳腺MDA-MB-231細胞和MDA-MB-435S細胞的增殖，誘導細胞的凋亡[7,12]。動物模型研究發現，乳康飲能夠能下調乳腺癌組織淋巴管生成相關因子VEGF-C、VEGFR-3、Ang-2蛋白水平的表達，干擾乳腺癌組織的淋巴管生成，降低微淋巴管密度，抑制乳腺癌的淋巴轉移[13,14]。文獻報道乳康飲組成中的單藥，大多數對乳腺癌的治療有肯定的作用，如黃芪注射液在體外對乳腺癌MCF-7可起到抑制腫瘤細胞生長和遷移的作用[15]。莪術的主要活性成分莪術醇對乳腺癌細胞增殖有明顯的抑制作用，對MDA-MB-231細胞的侵襲能力亦有較強影響，且具有一定的濃度依賴性，莪術提取物莪術石油醚也能抑制乳腺癌細胞的轉移侵襲能力，作用機制可能與上調細胞黏附因子E-cadherin有關[16]。

莪術二酮能明顯抑制人乳腺癌HCC1937細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與通過下調MAPK和Akt信號通路上關鍵蛋白ERK、JNK、Akt的磷酸化水平，進而使MMP-2、MMP-9表達量下降有關[17]。柴胡皂苷D也能呈時間及濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，下調與細胞黏附、遷移、侵襲相關基因vimentin和N-cadherin蛋白和mRNA的表達水平。茯苓的有效成分茯苓三萜可通過抑制MAPK信號通路的激活，從而抑制腫瘤細胞的EMT，進一步抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，發揮抑制乳腺癌生長和轉移的作用。

本實驗研究顯示，乳康飲和拆方為疏肝理氣組和益氣健脾組的含藥血清，均能夠對乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲發揮明顯抑制作用，益氣健脾組的抑制作用相對較弱，乳康飲全方組優于疏肝理氣組和益氣健脾組，提示全方配伍后，能夠增強對乳腺癌細胞的抑制作用，具體的作用機制有待進一步深入研究。由于中醫藥防治乳腺癌復發與轉移是多靶點與多途徑的整合，具有整體觀念的優勢，又有辨證論治的靈活性，所以在以扶正培本為主、祛邪抗癌為輔的綜合治療基本治療理念上，發揮了中醫藥辨證論治的優勢，體現了乳腺癌的個體化治療理念。