全自動酶免分析儀校準方法的研究

管善國 陳 霈 孫文斐

酶聯免疫吸附測定方法是以酶免疫技術為基礎發展出的一種新型的免疫測定技術，依據酶標記的免疫復合物與酶的響應底物能夠產生顯色反應，顯色程度與被測樣品中待測抗體(或抗原)的含量有關，根據顯色物吸光度值確定待測物質含量，不同待測顯色物質有其各自的特征吸收譜線，并符合郎伯-比爾定律(Lambert-Beer law)，可通過吸光度的測量實現含量分析。酶標分析儀即用此原理，在臨床上可實現肝炎、艾滋病病毒、梅毒、腫瘤標記物以及風濕免疫類系列等數種病理診斷，具有靈敏度高，特異性強等特點。

由于分析過程中試劑樣品的定量加注、恒溫孵育過程較為耗時，工作量繁復，由此產生了集樣品試劑自動分配、孵育溫度控制以及吸光度測量為一體的全自動酶免分析儀，大幅提高了效率，隨著生產技術的提高，成本降低，生產廠家和型號不斷增加，其社會擁有量增多，在綜合醫療機構已有取代酶標儀的趨勢。

全自動酶免分析儀主要由儀器柜、裝載塔、樣品和試劑區、酶標板傳送系統、恒溫孵育倉、洗板機、比色器、讀數器、計算機和內部條碼掃描器組成。儀器通過加樣、溫育、洗板、加酶標物、加顯色劑、加終止液和比色過程獲得分析結果。其中比色器實現吸光度的測量，是最終測量結果的引用數據；洗板機實現洗板、加酶標物、加顯色劑以及加終止液功能，其洗板效果、加注試劑樣品的準確性直接影響測量結果；恒溫孵育倉實現樣品的預溫功能，由于測量時需保留樣品盒試劑原免疫活性與酶活性，對溫度設定和控制需要保證準確可靠。其他部分實現樣品貯存流轉和數據處理功能。

目前，尚無針對全自動酶免分析儀的檢定規程或校準規范。因此，根據儀器結構特點和工作原理，其校準工作主要包括吸光度和波長的校準、洗板機性能、注樣精度校準和孵育溫度校準三部分。由于國家計量檢定規程“酶標分析儀”(JJG861-2007)[1]中已經規定了酶標儀中吸光度和波長的檢定校準方法，在全自動酶免分析儀中關于吸光度和波長的校準方法可以參照該規程執行，但全自動酶免分析儀的洗板機性能和孵育溫度尚無校準方法。因此，將重點討論洗板機性能和孵育溫度的校準方法。

1 吸光度示值和波長校準

1.1 校準設備

校準設備使用酶標分析儀標準測試板、干涉濾光片和分光光度計。

1.2 校準方法

儀器比色系統實現吸光度測量，主要由光源、單色器、樣品室和檢測器構成。單色器有單波長和連續可調式，依據國家計量檢定規程“酶標分析儀”(JJG861-2007)[1]可實現全自動酶免分析儀吸光度示值誤差示值穩定性和重復性、波長示值誤差和重復性、靈敏度以及通道差異的校準。進行吸光度示值誤差、示值穩定性和重復性測試時，將標準吸光度板放入傳送帶，送入比色室，選取單一波長、吸光度測量模式以空氣作空白，即可讀取數據并判定結果。波長校準時，對連續波長方式由短波向長波逐點測出標準濾光片的波長-吸光度值，求出相應峰值波長，計算其誤差。對單波長方式，用分光光度計測量儀器所帶波長濾光片透過率，繪制波長-透射比特性曲線，計算其峰值結果。

2 洗板機性能校準

洗板機利用壓力泵正負壓將清洗液定量注入微孔板容器內對其進行清洗，再將微孔板容器內的清洗液吸入廢液瓶內，通過設定的重復清洗過程使微孔板達到清潔，其加注系統可實現加酶標物、加顯色劑和加終止液功能。根據沖洗壓力、沖洗距離、沖洗時間、震蕩、渦流、底部沖洗、兩點吸液以及連續式沖洗等需要可選擇多種方式。

洗板機主要由以下4部分組成：①控制顯示系統，設定工作程序、顯示設置參數以及計時等功能；②負壓系統，提供清洗液和廢液回收；③加注系統，可自動定位、注液和吸液；④微孔板架。加注系統具有精密定量注液和吸液功能，注液是洗板機向微孔內注入設定的液體體積，吸液是抽吸后的微孔內液體，其殘留液體越少越好。微孔板由多個微量器皿連接組成，用于盛裝微量液體供分析使用。洗板機主要參數有注液量、吸液殘留量、洗板次數、浸泡時間、延遲時間、吸液時間以及自動預洗間隔時間等。其中，注液量、吸液殘留量關系洗板效果，可改變試劑濃度，對后續檢驗的準確性具有重要影響。由于目前計時技術已達到毫秒或微秒水平，其以秒計時的誤差可忽略，故暫不考慮計時參數校準。

根據洗板機的工作原理，其主要特點是小液體的反復加液和吸液，經過一定工作時間后其負壓系統穩定性會發生改變，吸液效果降低。使用中清洗頭難免會有污染，從而影響加液準確性，而用戶無法自行檢測發生的變化，會對檢驗結果的準確性產生較大影響。因而有必要采用科學合理的方法進行校準，根據洗板機特點，可參照國家檢定規程“移液器”(JJG646-2006)[2]中容量測量方法，采用衡量法進行加液量和殘液量準確性的校準，此次主要校準內容為加液量的準確性和殘留量以及通用要求。

2.1 主要技術要求

根據多數儀器技術指標和《廣東省洗板機產品注冊技術審查指導原則》(試行)[3]中主要技術要求為以下4項：①注液量最大允許誤差應≤±5%；②注液量重復性應≤2.5%；③吸液殘留量應≤3 μl/孔；④吸液殘留量重復性應≤1.5 μl/孔。

2.2 校準條件

(1)室溫(20±5)℃且室溫變化應＜1 ℃/h，相對濕度為40%～80%。不應有明顯風速和影響天平工作的振動，避免陽光照射，同時實驗室不應有影響天平正常工作的磁場和振動，且周圍無腐蝕性氣體和液體。

(2)校準介質應符合國家標準“分析實驗用水規格和實驗方法”(GB6682-2008)要求[4]的蒸餾水或去離子水，其溫度與室溫應≤2 ℃。

2.3 校準設備

洗板機校準所用設備選用Ⅰ級電子天平和分度值為0.01 ℃的數字溫度計。

2.4 校準項目和校準方法

(1)外觀檢查。被校準的裝置不應有影響正常工作的機械損傷，各控制開關靈活可靠，微孔板可穩定放置于工作面且動作正常。

(2)注液量最大允許誤差和殘留量的校準。盡量選擇單注液和單吸液方式，應在覆蓋注液量范圍內選取不少于兩個校準點或根據客戶要求選取校準點。校準時選取相應未使用的微孔板，稱量空板，反復洗板2次。分別稱量加液后和吸液后的質量，每次稱量前應用吸水紙吸附微孔板底部的水分，重復操作稱量6次。校準過程中實驗用介質溫度波動應≤±1 ℃，目測微孔板注液面和殘留液面應無明顯差異。每次稱量并計算注液量(公式1)和殘留量(公式2)：

式中VI為被檢儀器的注液量(μl)，VC為被檢儀器的殘留量(μl)，m1，m2，m3分別為天平稱量的空板、注液后和抽液后的微孔板質量(mg)，k(t)為蒸餾水的溫度密度系數，N為選取測量的微孔數。

注液量相對誤差計算為公式3：

式中V0為設定注液量(μl)，為6次注液量的算術平均值(μl)。

(3)注液量和殘留量的重復性校準。重復性計算為公式4：

式中Vi為每次測量的注液量或殘留量值為注液量或殘留量的算術平均值(μl)，n為測量次數。

(4)洗板機校準中的功能選擇。校準過程中不選用振動及浸泡功能，盡量避免沾帶水份，取出酶標板后稱量應迅速，以減少液體揮發，實驗證明在穩定環境中，30 s的測量時間對稱量結果可忽略不計。隨時檢查廢液瓶中的廢液，應該在廢液超出三分之二時，及時將廢液倒掉。

3 孵育溫度的校準

3.1 技術要求

參照國家計量技術規范“環境試驗設備溫度、濕度校準規范”(JJF1101-2003)[5]方法及儀器技術要求，溫控精度為±0.2 ℃，溫度波動性為±0.1 ℃。由于儀器樣品室空間較小，可選擇中心單點測量，溫度均勻性未做考慮。

3.2 校準方法

將數字溫度計探頭置于孵育箱內樣品中心位置，將儀器溫度設定到所需溫度，待儀器工作正常溫度顯示穩定后開始讀數，每2 min記錄1次，30 min共測試15次。

3.3 溫度偏差計算

溫度偏差計算為公式5：

式中Δtd為溫度偏差(℃)，td為中心點n次測量的算術平均值(℃)，t0為設備顯示溫度的平均值(℃)。

3.4 溫度波動度計算

以30 min內(2 min/次)樣品中心點實測最高溫度與最低溫度之差的一半，其計算為公式6：

式中Δtf為溫度波動度(℃)，t0max為中心點n次測量的最大值(℃)，t0min為中心點n次測量的最小值(℃)。

4 校準中的注意事項

在吸光度校準時應避免采用振動模式，隨時注意標準濾光片是否有污染。為保證洗板機的性能可靠，使用中應注意保護清洗頭，并注意與空板的位置是否偏移，樣品池在酶標儀板中是否放置水平，酶標板應平穩放置在載架中間。運行時要隨時檢查廢液瓶中的廢液，應在廢液超出三分之二時及時將廢液倒掉。關機前用蒸餾水進行至少5次清洗洗板機內部操作，關機后將洗液瓶內的洗液移出，避免結晶后堵塞洗板頭。如果洗板機較長時間不使用時，需將洗板頭拔下，泡于蒸餾水中。

5 結論

隨著醫療機構近年來全自動酶免分析儀使用量的不斷增加，僅依據國家計量檢定規程“酶標分析儀”(JJG861-2007)[1]對全自動酶免分析儀開展校準工作已不能滿足實際檢測需求[6]。此次重點對全自動酶免分析儀吸光度、波長之外的洗板性能和溫度指標校準技術進行了探討和完善。根據提供的方法，在實際校準工作中可及時發現在用洗板機功能負壓系統的穩定性變化、加液量準確性以及殘留量的異常，指導客戶或維修單位及時查找原因排除故障，為保證臨床檢驗結果準確提供良好的技術支持。