鈦種植體表面不同抗菌處理方式對細菌粘附能力的影響研究*

鮑合剛 李 俊 鐘 飛 王金蘭 何 坤

口腔種植材料—鈦金屬，具有良好的機械性能和抗腐蝕作用而廣泛用于口腔種植相關領域。鈦種植體表面需要具備促進骨整合、抑制菌斑形成等功能，而細菌粘附、生物膜的形成是引起種植體周圍炎，并最終引起種植失敗的主要原因[1]。為了降低種植體周圍炎發生率，除了保持良好的口腔衛生外，亦可通過改良種植體表面特性，減少細菌粘附。種植體表面粗糙度對細菌粘附力影響會隨著種植體表面生物膜的成熟而消失，但是臨床上對于種植體表面粗糙度對細菌粘附的影響機制尚未明確[2-4]。因此，臨床上多數學者開始致力于種植體表面改性研究。隨著材料微處理技術的興起，使得陽極氧化純鈦表面形成TiO2納米管，具有良好的生物活性及成骨性能[5]。但是，臨床上對于抗菌性能的影響研究較少。為此，本研究以TiO2納米管作為研究對象，探討其表面加載抗菌藥物與激光照射表面抗菌處理的兩種抗菌方法對鈦種植體中間普氏菌粘附能力的影響。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選擇規格為TA2的純鈦片，將TA2純鈦片進行陽極氧化獲得36片粘附細菌效果最好的TiO2納米管，按照不同抗菌處理方法將其隨機分為對照組和觀察組，每組18片。對照組種植體表面采用載入鹽酸米諾環素藥物對TiO2納米管進行抗菌處理，觀察組種植體表面采用激光照射進行抗菌處理，測量不同時間節點細菌粘附數量，并測試其鈦表面性能。

1.2 儀器與試劑

采用商業純鈦(西北有色金屬研究院)；中間普氏菌(上海市口腔醫學研究所)；LS-450型輝光離子滲金屬真空爐(北京儀器廠)；MIP-8-800型多弧離子鍍膜機(中國科學院力學研究所)；S-4800型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；Axiovert 25 CA光學圖像分析儀(德國Zeiss公司)；血瓊脂平板(武漢博士德生物有限公司)。

1.3 鈦種植體表面處理及細菌粘附測試

1.3.1 鈦種植體表面處理

(1)鈦種植體表面經碳化硅砂紙順序拋光至1500目，然后通過0.3%氫氟酸和1 mol/L磷酸的氧化電解液，陽極為鈦片，陰極為石墨電極，在直流電源室溫下氧化處理1 h，再用無水乙醇和去離子水超聲清洗30 min，消毒干燥，獲得所需TiO2納米管。

(2)將TA2純鈦片切割為10 mm×10 mm×0.5 mm的薄片(36片)待用。表面經碳化硅砂紙順序拋光至1500目，用丙酮、無水乙醇及去離子水依次超聲清洗15 min，自然干燥。根據鈦片表面是否陽極氧化及氧化時所用電壓為10 V和20 V，分別進行表面經砂紙順序拋光后噴砂酸蝕(sandblasted acid etched，SLA)處理、電壓為10 V納米管陽極氧化處理和電壓為20 V納米管陽極氧化處理。獲取不同管徑大小和不同表面形貌的TiO2納米管，通過納米管表面細菌粘附效果分析，獲得粘附效果最好的納米管組，并為其組納米管表面進行加載抗菌藥物以及激光照射做準備。

(3)陽極氧化生成TiO2納米管。選用0.3%氫氟酸和1 mol/L磷酸為氧化電解液，陽極為鈦片，陰極為石墨電極，直流電源室溫下氧化處理1 h，而后熱處理升溫至500 ℃再冷卻至室溫。試件皆用無水乙醇和去離子水超聲清洗30 min，消毒干燥。①在電場的作用下，鈦表面形成致密的氧化鈦阻擋層；②F-與阻擋層發生化學作用形成可溶性的TiF-，形成不規則凹痕；③凹痕逐漸發展成小孔；④小孔密度增加，在表面形成有序結構；⑤阻擋層推進的速度與氧化層的溶解速度相等時，孔的長度停止增加。電化學陽極氧化設備見圖1。

圖1 電化學陽極氧化設備示意圖

1.3.2 細菌粘附測試

(1)試件表面形貌觀察及細菌粘附分析。在每組內取3個試件，分別進行掃描電鏡觀察、原子力顯微鏡觀察和X射線衍射分析。對中間普氏菌的粘附效果分析，將中間普氏菌浸于腦心浸液肉湯(brain heart infusion，BHI)溶液中，浸液瓊脂平板37 ℃培養24 h，配成菌液待用。每組選取試件各10個放入培養板內，吸取菌液接種于試件表面，按流程培養，分別在培養后24 h、72 h和120 h進行菌落計數。試件細菌種植后，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗，脫水，干燥。試件噴金后掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察細菌形態。

(2)抑菌效果。選取對中間普氏菌粘附效果最好的一組，繼續制作試件36個并接種中間普氏菌分為觀察組和對照組：對照組給予載入抗菌藥物鹽酸米諾環素，觀察組采用激光照射處理，選擇激光波長為500 nm的低強度照射5 min，對比兩組處理后鈦表面的抗中間普氏菌的性能，每組試件放入培養板內，吸取菌液接種于試件表面，按流程培養，分別于24 h、72 h和120 h進行菌落計數。各組選取1個試件抗菌接觸實驗終止后，PBS漂洗，加入熒光染色劑，觀察熒光強度并計算死菌/活菌比值。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析，數據采用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，經Levene's方差齊性檢驗，方差齊性者采用Bonferroni進行兩兩分析比較；若方差不齊者，則采用Games-Howell法進行比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TiO2納米管掃描電子顯微鏡結果

對照組處理后僅使原有表面粗糙度值略微增加，但均＜0.2 μm；掃描電鏡結果中對照組處理后材料表面原始劃痕消失；觀察組處理后表面為一層均勻致密層，且為多孔隙結構。TiO2納米管掃描電子顯微鏡圖像見圖2。

圖2 TiO2納米管掃描電子顯微鏡圖像(×1000)

2.2 兩組不同時間點細菌集落平均數比較

觀察組與對照組納米管鈦表面吸附菌落總數，對照組隨著時間的延長細菌集落平均數呈上升趨勢。不同時間點細菌集落平均數比較分析，觀察組激光照射后與對照組抗菌鈦表面的抗中間普氏菌的性能處理24 h、72 h細菌數比較，差異無統計學意義(t=1.295，t=1.058；P＞0.05)；觀察組通過激光照射后納米管鈦表面的抗中間普氏菌120 h細菌平均數少于對照組，其差異有統計學意義(t=9.683，P＜0.05)，見表1。

表1 兩組不同時間點細菌集落平均數比較(106CFU，)

表1 兩組不同時間點細菌集落平均數比較(106CFU，)

2.3 兩組細菌熒光染色分析

細菌熒光染色結果表明：觀察組處理后細菌熒光染色數量較少，而對照組處理后細菌熒光染色數量相對較多。細菌熒光染色分析見圖3。

圖3 兩組細菌熒光染色分析圖像(×1000)

2.4 兩組表面處理后掃描電鏡下細菌數比較

對照組表面處理后掃描電鏡下細菌數量相對較多，且細菌相對集中；觀察組表面處理后細菌數量相對較少，細菌分布相對分散。兩組表面處理后掃描電鏡下細菌數見圖4。

圖4 兩組表面處理后掃描電鏡下細菌數比較(×2500)

3 討論

近年來，隨著口腔種植技術的不斷發展，純鈦成為口腔種植植入材料，由于良好的機械性能及生物相容性良好而在臨床上廣泛使用。但是，由于純鈦自身良好的金屬特性，導致其齦緣薄弱部位容易透出金屬、金屬離子析出，影響牙齦著色美觀[6-7]。本研究中，陽極氧化處理后使原有表面粗糙度值略微增加，但是均＜0.2 μm；掃描電鏡結果表明，對照組處理后材料表面原始劃痕消失；觀察組表面處理后為一層均勻、致密層，且為多孔隙結構，鈦表面形成復合物，表明純鈦在口腔種植中效果理想，結構致密，符合口腔種植需要。國內外學者[1，4，8]研究表明，菌斑聚集是種植體周圍炎發病始動因素，而細菌的粘附、定植被視為感染的關鍵作用，且細菌的定植具有一定的順序，鏈球菌、放線菌是早期常見的定植菌，能為細菌后期定植提供表面粘附作用。普氏菌是口腔鏈球菌的主要菌種，對牙面具有良好的親和力，但是細菌的粘附機制尚未明確，多與材料、微生物及宿主等因素有關[9-10]。

本研究中，觀察組與對照組隨著時間的延長細菌集落平均數呈上升趨勢，不同時間點細菌集落平均數比較具有統計學意義；觀察組與對照組材料表面處理后24 h、72 h細菌數比較無統計學意義；觀察組表面處理后120 h細菌平均數少于對照組；細菌熒光染色結果中，觀察組處理后細菌熒光染色數量較少，而對照組處理后細菌熒光染色下數量相對較多，表明TiO2納米管表面定植細菌隨著時間的延長定植數量增多，而觀察組給予表面處理后表面定植的細菌數量較少，激光照射處理后抗菌粘附效果較好。激光照射技術是一種新型的干預方法，通過對工件表面進行設計與激光表面處理，從而改變表面性能[11]。同時，該方法利用激光光束快速、局部加熱條件，能在短時間內改變材料表面性質，結合臨床所需改變激光參數，可以解決不同表面處理工藝問題[6，12]。臨床上，激光照射處理根據表面處理的目的不同分為激光重熔、激光涂覆及去除處理等，均能實現表面性能改善，能選擇性的處理鈦種植體表面，使得材料表面獲得足夠的韌性與強度，獲得耐磨、抗氧化及耐腐蝕等性能[3，6，13]。本研究中，將處理后的標本放置在熒光顯微鏡下進行觀察，利用圖像分析儀測定樣本表面細菌粘附比，結果表明，對照組表面處理后細菌數量相對較多，且細菌相對集中，但觀察組表面處理后，細菌數量相對較少，細菌分布相對分散，表明TiO2納米管經過激光照射處理后細菌粘附性降低，能增強材料的抗菌粘附性能。既往研究中，激光處理后能在TiO2納米管表面形成一層均勻的、致密的改性層，能抑制金屬鈦的活躍性，形成性質較為穩定的氧化膜，從而能發揮細菌抑制作用。但是，臨床上由于TiO2納米管的用途、使用目的存在明顯的差異性，在表面處理時應結合本實驗室的情況選擇合適的方法，盡可能減少鈦種植體周圍菌斑附著，降低局部組織炎癥，提高臨床種植成功率，促進患者早期恢復[12-15]。

4 結論

TiO2納米管經過兩種表面處理后均能形成較為穩定的表面改性層，且采用激光照射處理效果更佳，能減少細菌的粘附，有望成為應用于種植體穿齦部、種植體基臺部表面處理技術。