左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠行為學影響及神經保護機制研究

王 睿 吳睦霖 王 偉 邢宇雙 常金龍

現代醫學認為，圍絕經期抑郁癥是一種常見的由生物、社會及心理等共同作用的心境障礙性疾病，與遺傳、神經內分泌功能失調、社會心理應激、神經可塑性障礙等因素有關[1]。其中社會心理應激+低雌激素水平被認為是圍絕經期抑郁癥主要致病原因。古代中醫認為，圍絕經期抑郁癥為“情感失調、病位在腦、腎腦失濟”所致，其本質為“腎陰虧虛、肝火亢盛、擾動心神”，即腎精不足影響腦的形態與功能，“腎精虧虛-腎腦失濟”是致病之本和主要病機[2]。

對于圍絕經期抑郁癥治療，西醫臨床多基于抑郁癥“單胺類神經遞質缺乏”學說，采用單用抗抑郁藥物，即三環及四環類抗抑郁藥(米帕明、氯米帕明、阿米替丁等)、選擇性5-HT再攝取抑制劑(氟西汀、帕羅西汀、舍曲林等)及單胺氧化酶抑制劑(異煙肼、氯丙胺等)，單用激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)和激素+抗抑郁藥物治療。但因抗抑郁西藥“臨床效應時間滯后”現象、不良反應大及成癮性，孕激素耗竭維生素B6，雌激素(estrogen，E)致癌性(乳腺癌、子宮內膜癌)使其紛爭不斷。

“補腎健腦”是中醫臨床治療腦病特色療法。中藥以效應廣泛、毒性不良反應小、協同作用強特點，在圍絕經期抑郁癥這種病因不清、致病危險因素多、發病機制復雜的情志疾病中具有獨特優勢。中藥可通過“眾多顯效形式的單靶點疊加作用、多靶點協同作用及毒性分散效應”發揮藥效并削弱自身毒性[3]。

左歸丸出自《景岳全書·新八方陣》，為明代醫家張景岳“滋陰補腎，益精填髓”代表名方，主要由熟地、山藥、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿角膠、龜板膠八味藥物組成，用于腎陰虛所致諸多癥狀[4]。現代醫學研究表明，左歸丸具有神經保護作用及植物雌激素活性，對腦損傷具有神經保護作用，可緩解腎陰虛所致更年期綜合征等婦科疾病，可調節患者腎陰虧虛、肝血不足及情志失調引起的陰陽失衡[5～7]。本研究以圍絕經期抑郁癥小鼠模型為研究對象，探討左歸丸抗圍絕經期抑郁癥的神經保護作用及機制，為臨床抗抑郁癥藥物研發提供新的方向。

材料與方法

1.材料：藥品與試劑：左歸丸(上海雷允上封浜制藥有限公司，批號151012)，鹽酸氟西汀膠囊(Fluoxetine，FLU，蘇州禮來制藥，批號2076AC)，戊酸雌二醇(拜耳醫藥有限公司，批號258A2)，全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術，批號062916160817)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術，批號032516160711)，小鼠E2、5-HT、NE、DA 試劑盒購自北京誠林生物技術有限公司，批號分別為20180601、20170204、20170201、20170106，CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB、β-Actin、山羊抗兔IgG/HRP多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術公司，批號分別為999802W、99983F、14D526、9H124、AF11026274、AF12114126，其他試劑均為國產分析純試劑。

2.主要儀器：曠場反應箱(上海移數信息科技有限公司)，小鼠懸尾裝置(自制)，TECAN酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

3.實驗動物：清潔級雌性昆明小鼠，體質量20±2g，購自齊齊哈爾醫學院實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(黑)2016-001。

4.動物模型制備、分組及給藥：OFT篩選評分相近小鼠60只，適應性飼養1周。根據SPSS 19.0統計學軟件產生隨機數字分為6組，即假手術組、圍絕經期抑郁癥模型組、氟西汀+雌激素組(FLU+E2組，3mg/kg+0.15mg/kg)、左歸丸低、中、高劑量組(11.5mg/kg、23.0mg/kg、46.0mg/kg)，每組10只。小鼠飼養條件、圍絕經期抑郁癥模型制備方法、卵巢切除術前及術后飼養方法、CUMS刺激方式參照文獻[8]。

5.曠場實驗(open filed test，OFT)：OFT可以檢測大、小鼠在新奇環境中的自主活動(水平運動得分)、探索活動(垂直運動得分)及緊張恐懼程度(糞便例數)[8]。懸尾實驗(tail suspension test，TST)：TST最早由法國藥理學家Luscien Steru等根據“搜索-等待策略”原理建立，可用于評價和篩選抗抑郁藥物[9]。以上兩組實驗在應激第1天、第21天(9:00～11：00時)各測定1次，平行實驗并對測試者設盲，避免“希望效應”。

6.血清E2含量測定：行為學測試結束后，小鼠摘眼球，取血，4℃勻漿，2300r/min離心10min，靜止，吸取上清，-80℃保存。按照ELISA法試劑盒說明書進行操作，測定血清E2含量。腦組織單胺類神經遞質含量測定：行為學測試結束后取腦組織，ELISA法測定腦組織單胺類神經遞質5-HT、DA及NE含量[10]。

7.海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB蛋白含量測定：采用Western blot法檢測蛋白表達。行為學測試結束后取腦海馬組織，投入液氮中研磨，經蛋白抽提→定量→上樣(每孔上樣量20μg)→電泳(電壓100V、15min，進入分離膠后，電壓120V，90min)→濕法轉膜(100V，90min)→5%脫脂奶粉封閉→兔源一抗(CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB及β-actin抗體稀釋濃度分別為1∶800、1∶800、1∶800、1∶800及1∶1000)孵育(4℃、過夜)→山羊抗兔IgG/HRP(1∶2000)孵育(室溫，120min)→ECL顯色。采用目的條帶/內參條帶吸光度作為結果進行統計分析。

結 果

1.左歸丸可改善圍絕經期抑郁癥模型小鼠抑郁樣行為：(1)OFT：應激第1天，各實驗組小鼠水平運動及垂直運動得分比較差異無統計學意義(P>0.05)。應激第21天，與假手術組比較，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠OFT水平運動及垂直運動得分減少；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，可增加OFT水平運動及垂直運動得分；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量組較為明顯；差異有統計學意義(P<0.05，表1)。(2)TST：應激第1天，各實驗組小鼠懸尾不動時間比較差異無統計學意義(P>0.05)。應激第21天，與假手術組比較，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠懸尾不動時間增加；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，小鼠懸尾不動時間減少；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量組較為明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠行為學影響

與假手術組比較，*P<0.01；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

2.左歸丸可增加圍絕經期抑郁癥模型小鼠血清E2含量：與假手術組比較，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠血清E2含量減少；與圍絕經期抑郁癥模型組小鼠比較，給予FLU+E2、左歸丸各劑量組治療后，小鼠血清E2含量增加；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠單胺類神經遞質、E2含量影響

與假手術組比較，*P<0.01；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

3.左歸丸可增加圍絕經期抑郁癥模型小鼠腦組織單胺類神經遞質含量：與假手術組比較，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠腦組織5-HT、NE、DA含量減少；與圍絕經期抑郁癥模型組小鼠比較，給予藥物治療后，腦組織5-HT、NE、DA含量增加；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

4.左歸丸可上調小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達：與假手術組比較，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達減少；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，給予各藥物治療后，可上調海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達；左歸丸各劑量組組間比較，以中劑量較為明顯；差異有統計學意義(P<0.05，表3，圖1)。

表3 左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠海馬組織主要蛋白表達影響

與假手術組比較，*P<0.01；與圍絕經期抑郁癥模型組比較，#P<0.01；與左歸丸各劑量組比較，△P<0.05

圖1 左歸丸對各組小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達影響A.假手術組；B.圍絕經期抑郁癥模型組；C.FLU+E2組；D.左歸丸低劑量組；E.左歸丸中劑量組；F.左歸丸高劑量組

討 論

圍絕經期女性因社會心理應激敏感度增加，體內雌激素水平下調致使抑郁癥高發。抗抑郁西藥+HRT為臨床治療圍絕經期抑郁癥主要方法，但因藥物諸多不良反應面臨瓶頸。因此，從祖國醫學中尋求高效、低毒、具有神經保護及抗抑郁作用中藥制劑具有重要的現實意義。

本研究中筆者基于中醫“腎腦相關”理論，采用FLU+E2作為陽性對照藥物，采用OVX+CUMS法建立圍絕經期抑郁癥小鼠模型，通過4個方面評價左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠行為學影響及神經生物學機制[11]。

在圍絕經期抑郁癥模型制備中，筆者采用小鼠雙側OVX方式模擬圍絕經期“雌激素撤退”病因學說，采用CUMS方式模擬外界環境刺激，經預實驗測試，結果顯示，圍絕經期抑郁癥模型組小鼠表現抑郁樣行為，使用左歸丸治療后，可改善各組小鼠抑郁樣行為。筆者不但驗證了復合模型能夠較大程度模擬圍絕經期抑郁癥相似病因，說明模型制備是成功的；也證實了選用具有“滋陰補腎、填精益髓”、兼備植物雌激素活性的左歸丸具有拮抗抑郁癥作用，筆者的研究進一步拓寬了左歸丸的藥用價值。

在闡明抑郁癥發病機制研究中，“單胺類神經遞質缺乏”學說具有里程碑性質的意義。單胺類神經遞質主要包括5-HT、DA及NE，其代謝產物對神經、內分泌及心血管系統具有重要的調節作用，并對情感、情緒及行為活動產生影響。臨床上抗抑郁癥藥物研發多基于此學說，通過多種途徑靶向增加突觸間隙單胺類神經遞質含量達到抗抑郁癥效果。基于此，筆者探討左歸丸對腦單胺類神經遞質影響，結果發現，左歸丸可上調圍絕經期抑郁癥模型小鼠腦組織單胺類神經遞質含量。

“雌激素水平下降”是圍絕經期抑郁癥患者獨有特征。雌激素為“天然的神經營養因子”，可透過血腦屏障并在腦內、外合成，可調節女性生殖功能、腦發育、突觸可塑性、學習記憶及認知功能，可通過抗炎、抗氧化應激、抑制神經元凋亡、調控腦單胺類神經遞質及受體信號通路、促進神經營養因子表達、通過γ-氨基丁酸(GABA)途徑調節HPA軸具有神經保護作用。基于此，筆者發現，左歸丸可增加圍絕經期抑郁癥模型小鼠血清E2含量。

“海馬神經可塑性障礙”是近年來抑郁癥病因學最具突破性理論。該學說認為，抑郁癥發生與海馬神經可塑性失調密切相關[12]。神經可塑性即腦可塑性，指中樞神經系統在結構和功能上的可修飾性，具體表現為神經元、神經膠質細胞損傷變化與神經元內信號轉導通路發生障礙，主要包括神經再生(樹突延伸、樹突棘密度變化、軸突生長、軸突發芽、突觸再生等)、突觸可塑性調節(長時稱增強、長時程抑制)等。CREB/BDNF信號通路被認為是海馬神經可塑性調節關鍵信號因子，該信號通路相關蛋白表達與抑郁癥發生、發展關系密切，為各種信號蛋白信息轉導交匯點[13]。基于此，筆者采用Westeron blot法檢測各組小鼠海馬組織CREB/BDNF信號通路主要蛋白表達。結果發現，左歸丸可上調該信號通路CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表達。

綜上所述，左歸丸對圍絕經期抑郁癥模型小鼠抑郁樣行為具有拮抗作用，其中以中劑量最為顯著。左歸丸腦保護作用的神經生物學機制與上調單胺類神經遞質5-HT、NE、DA含量、上調血清E2含量、上調CREB-BDNF/TrkB信號通路主要蛋白表達有關。