人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能影響及機(jī)制研究

羅文娟 王燦敏 葉敏宜

百草枯(1,1-二甲基-4,4二氯二吡啶，PQ)作為一種除草劑被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，百草枯誤服進(jìn)入體內(nèi)會(huì)引起肺、肝臟、腎臟、肌肉等組織器官的急性不可逆損傷，中晚期會(huì)肺部纖維化而造成呼吸衰竭，引起死亡[1,2]。目前，百草枯引發(fā)損傷的機(jī)制尚不明確，常用的治療藥物主要有抗纖維化制劑、抗氧化劑、免疫抑制劑以及糖皮質(zhì)激素等，但是并沒有有效的拮抗藥物，臨床治療仍然存在巨大挑戰(zhàn)[3]。

傳統(tǒng)中藥三七具有活血化瘀、消腫止痛的藥理作用，其主要成分是三七總皂苷，包括人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等，其中人參皂苷Rb1作為主要的活性單體成分之一，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等藥理作用，藥效明顯且對(duì)多種疾病皆有明顯的調(diào)節(jié)作用[4～6]。但是人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致的肺部纖維化以及呼吸衰竭的作用及機(jī)制并未有研究報(bào)道。Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，調(diào)控多種蛋白的表達(dá)，其中包括對(duì)肺纖維化標(biāo)志物MMP表達(dá)的調(diào)控，但人參皂苷Rb1是否能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路而影響百草枯所致肺部纖維化尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在探究人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能的影響，通過(guò)檢測(cè)肺干濕重比評(píng)價(jià)肺水腫情況，檢測(cè)炎性因子水平以評(píng)價(jià)體內(nèi)炎性反應(yīng)程度，通過(guò)病理切片觀察三七皂苷對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的影響，并通過(guò)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)，以探究其潛在作用機(jī)制，為臨床的治療提供幫助。

材料與方法

1.材料：健康清潔級(jí)SD大鼠，50只，體質(zhì)量150～180g[南京卡文斯生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXY(蘇)2016-0010]；百草枯原液[濃度20%，由英國(guó)先正達(dá)(中國(guó))科技股份有限公司生產(chǎn)]；人參皂苷Rb1(四川成都瑞芬思生物科技限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA檢測(cè)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)；GRP78抗體、β-catenin抗體、GAPDH抗體、MMP2抗體、HRP-羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物技術(shù)有限公司)；超敏發(fā)光液(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物技術(shù)有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG Omega公司)；電泳儀(南京大學(xué)儀器廠)；微型垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；AniRes2005動(dòng)物肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司)。

2.動(dòng)物造模及給藥：將50只SD大鼠隨機(jī)分成5組，即G1組(對(duì)照組)、G2組(模型組)、G3組(人參皂苷Rb1低劑量組)、G4組(人參皂苷Rb1中劑量組)、G5組(人參皂苷Rb1高劑量組)，G2、G3、G4、G5各組均用20%的百草枯溶液以40mg/kg的劑量灌胃，構(gòu)建大鼠百草枯中毒呼吸衰竭模型，G1組給予等體積0.9%NaCl溶液；造模1天后各組給藥治療7天(具體給藥設(shè)置、給藥劑量、給藥方式見表1；治療期間每天測(cè)量大鼠體質(zhì)量變化，觀察大鼠活動(dòng)、精神、呼吸及飲食等生理狀況；7天后，取血并處死大鼠，解剖取肺組織，拍照觀察。

表1 人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能影響實(shí)驗(yàn)給藥分組

3.大鼠肺功能檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，于喉部切開，分離氣管與呼吸機(jī)連接，外力加壓，使大鼠深吸氣、深呼氣，AniRes2005動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)大鼠肺功能各指標(biāo)，主要檢測(cè)指標(biāo)有25%肺活量的最大呼氣流量(FEF25)、50%活量的最大呼氣流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼氣流量(FEF75)、用力最大呼氣流量(PEF)。

4.肺濕干重比(W/D)檢測(cè)：給藥7天結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，解剖取大鼠肺組織，分離左肺后稱重計(jì)為濕重；稱重后將左肺置于60℃烘箱中干燥24h，稱重計(jì)為干重；肺濕干重比(W/D)=濕重/干重，用于評(píng)價(jià)肺水腫情況。

5.ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量：給藥7天結(jié)束后，取血，將所取血液3000×g、4℃離心5min，收集上層血清于無(wú)菌離心管中；按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品孔加入40μl待測(cè)樣品和10μl生物素標(biāo)記抗體，然后分別在標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔100μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，37℃孵育75min后，清洗5次并棄盡孔內(nèi)液體，分別加入50μl顯色劑Ⅰ/Ⅱ，避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl終止液，使用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

6.組織HE染色：取各組大鼠右肺于組織固定液中固定72h，經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、石蠟浸泡與包埋后制成組織切片，然后將石蠟切片進(jìn)行透明水化、蘇木精-伊紅(HE)染色、封片后于顯微鏡下觀察拍照。

7.Western blot法檢測(cè)肺組織β-catenin、 GRP78、MMP2的表達(dá)：取各組大鼠肺組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，用勻漿機(jī)冰上充分勻漿后于4℃繼續(xù)裂解30min， 12000r/min離心5min，取上清即為總蛋白；BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2h，然后以稀釋后的GAPDH、GRP78、MMP2一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說(shuō)明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30s，曝光并拍照，用Image J軟件曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用 GraphPad Prism 5 軟件制圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間均數(shù)比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況觀察：對(duì)照組大鼠進(jìn)食和飲水正常，體質(zhì)量上升明顯，呼吸平穩(wěn)正常，無(wú)異常反應(yīng)；模型組大鼠給藥1～2天即出現(xiàn)精神萎靡、身體發(fā)抖、進(jìn)食和飲水均減少，且出現(xiàn)呼吸急促、頻繁張口等呼吸衰竭樣體征等異常體征；3～7天上述現(xiàn)象更加顯著，呼吸更加急促且出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸等現(xiàn)象，表明呼吸衰竭加重，提示百草枯所致呼吸衰竭造模成功；人參皂苷Rb1低劑量組亦出現(xiàn)上述現(xiàn)象，但均輕于模型組；隨著人參皂苷Rb1給藥劑量的加大，中劑量組和高劑量組大鼠以上異常體征也逐漸減弱；體質(zhì)量變化見圖1。

2.人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能影響：根據(jù)各組大鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果(表2)，與對(duì)照組比較，模型組FEF25、FEF50、FEF75、PEF均顯著下降(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組FEF25、FEF50、FEF75、PEF均顯著上升(P<0.05)。

3.人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺組織濕干重比影響：模型組大鼠左肺的濕干重比均高于對(duì)照組(P=0.000)，模型組大鼠肺水腫明顯；人參皂苷Rb1低、中、高各組濕干重比均顯著小于模型組(P<0.01)，并且隨著給藥劑量的增加肺組織水腫逐漸減輕(表3)。

圖1 人參皂苷Rb1低、重、高劑量對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠體質(zhì)量影響

表2 人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能的影響

與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

表3 人參皂苷Rb1低、中、高劑量對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺濕干重比影響

與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P=0.000

4.人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β影響：ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β濃度結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rb1低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著上升(P=0.000)；與模型組比較，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著減少(P=0.000)，且呈現(xiàn)濃度依賴性(表4)。

表4 人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β影響

與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

5.人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)影響：對(duì)照組大鼠肺組織顏色鮮紅、質(zhì)地柔軟、表面光滑且顏色均一、表面無(wú)斑點(diǎn)和出血點(diǎn)、無(wú)組織病變等現(xiàn)象；模型組大鼠肺組織顏色暗沉且發(fā)白，表面無(wú)光澤，質(zhì)地堅(jiān)硬、表面有明顯的出血點(diǎn)且有大量水泡出現(xiàn)、組織病變明顯，表明造模成功；人參皂苷Rb1低劑量組表面暗沉、質(zhì)地較硬、有明顯出血點(diǎn)和水泡，但組織病變情況均輕于模型組；隨著人參皂苷Rb1給藥劑量的增加，人參皂苷Rb1中劑量和高劑量組病變特征逐漸變?nèi)酰c空白對(duì)照組比較仍有明顯病變(圖2)。HE染色結(jié)果(圖3)顯示，對(duì)照組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔結(jié)構(gòu)完整且清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)無(wú)明顯的充血和水腫等不良病理變化；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重病變，無(wú)清晰的肺泡結(jié)構(gòu)，有嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)水腫且充血極為顯著，并且伴有嚴(yán)重的微血栓生成；人參皂苷Rb1低劑量組肺組織結(jié)構(gòu)不完整，亦無(wú)清晰的肺泡結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大量的微血栓形成；隨著給藥劑量的增加，上述病理變化逐漸減輕，但是與對(duì)照組比較仍然存在明顯的病理改變。

圖2 各組大鼠肺組織形態(tài)比較圖A.對(duì)照組；B.模型組；C.人參皂苷Rb1低劑量組；D.人參皂苷Rb1中劑量組；E.人參皂苷Rb1高劑量組

圖3 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果比較圖(×400)A.對(duì)照組；B.模型組；C.人參皂苷Rb1低劑量組；D.人參皂苷Rb1中劑量組；E.人參皂苷Rb1高劑量組

6.人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺組織GRP78、MMP2以及Wnt信號(hào)通路中β-catenin蛋白表達(dá)水平的影響：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、人參皂苷Rb1低、中、高劑量組GRP78、MMP2、β-catenin的表達(dá)量顯著增加(P=0.000)，百草枯可引起肺部?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)MMP2的表達(dá)；與模型組比較，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組GRP78、MMP2、β-catenin的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，且隨著人參皂苷Rb1給藥劑量的增加GRP78、MMP2、β-catenin的表達(dá)量逐漸降低(圖4)。

討 論

百草枯作為一種毒性物質(zhì)，一旦進(jìn)入體內(nèi)就會(huì)引起人體不可逆的急性損傷，百草枯中毒24h以上會(huì)引起嚴(yán)重急性肺、腎臟、肝臟等重要器官的損傷[7]。其中肺組織尤為嚴(yán)重，出現(xiàn)肺部水腫和出血，中毒后肺組織纖維化，引起呼吸窘迫綜合征，后期因呼吸衰竭以及肺功能喪失而死亡[8]。目前對(duì)于百草枯所致的肺纖維化以及呼吸衰竭等損傷的機(jī)制尚不明確，已有研究表明，百草枯所致肺纖維化可能與炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、自由基氧化等有關(guān)[9]。臨床上百草枯中毒主要是由口服引起，故本實(shí)驗(yàn)采用20%的百草枯溶液灌胃的方法建立百草枯所致大鼠呼吸衰竭模型，給藥后使用動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)各組大鼠肺功能，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠顯著提高百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺功能。

圖4 人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致呼吸衰竭大鼠肺組織GRP78、MMP2、β-catenin相對(duì)表達(dá)量的影響G1、G2、G3、G4、G5組分別為對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rb1低、中、高劑量組；與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

百草枯所致肺組織損傷的主要臨床表現(xiàn)為肺纖維化所引起的嚴(yán)重肺水腫，本實(shí)驗(yàn)中，人參皂苷Rb1各給藥組肺組織濕干重比顯著降低，肺水腫情況得到有效緩解；炎性反應(yīng)是百草枯所致肺纖維化的主要臨床病理反應(yīng)，亦是肺組織纖維化的啟動(dòng)條件[10]。主要表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞等活化后釋放大量TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性性子，炎性因子的增多會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大肺組織炎癥，而本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，進(jìn)而緩解肺部炎癥[11]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指在機(jī)體出現(xiàn)缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊的蛋白質(zhì)會(huì)明顯增多，細(xì)胞會(huì)激活一些相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境[12,13]。已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的中性粒細(xì)胞激增會(huì)導(dǎo)致急性肺損傷，呼吸衰竭，引起死亡。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要成分之一，是參與蛋白質(zhì)的折疊和修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用，并且已經(jīng)被廣泛用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1會(huì)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78表達(dá)量降低，表明人參皂苷Rb1可能通過(guò)抑制肺部?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而起到治療作用。

Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，該通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin具有調(diào)控下游靶基因MMP表達(dá)的作用，在肺組織纖維化的過(guò)程中，MMP的表達(dá)量也上調(diào)，臨床上已將MMP作為肺纖維化的標(biāo)志物[16～20]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1各給藥組大鼠肺組織中β-catenin和MMP2表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明人參皂苷Rb1或可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路，降低MMP2的表達(dá)而降低肺組織纖維化。

綜上所述，人參皂苷Rb1對(duì)百草枯所致的大鼠呼吸衰竭有治療作用，其機(jī)制可能是緩解機(jī)體炎性反應(yīng)，抑制肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及抑制Wnt信號(hào)通路而降低MMP的表達(dá)，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。