食管鱗狀細胞癌中驅動基因的多組學關聯分析

席奕軼 施新澤 林 霖 郭文佳 劉天媛 王雨芊 林東昕 吳 晨

食管癌(esophageal cancer, EC)是原發于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，其發生率位居惡性腫瘤第6位，在全球腫瘤相關死亡中位居第8位[1]。食管癌的組織類型主要包括鱗癌和腺癌兩種，其中食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占全球食管癌病例的80%，尤其是中國，占比高達90%～95%，提示食管鱗癌相關研究的重要性[2～4]。

癌癥的發生、發展往往涉及基因變異、基因表達異常、表觀調控異常等多個層次的復雜調控機制。近年來，大規模測序研究已經在人類癌癥中發現多個腫瘤驅動基因。一項整合TCGA基因突變、甲基化譜和表達譜數據的泛癌分析研究揭示了腫瘤驅動基因在表觀基因組中重要的調控作用[5]。研究者通過整合704例食管鱗癌全基因組或外顯子組測序數據，鑒定了TP53、NOTCH1、MLL2、FAT1、NFE2L2、PIK3CA和EP300等20個驅動基因，其中93%(657/704)的患者存在至少一個驅動基因的體細胞突變[6～14]。然而尚未有研究系統探究驅動基因的體細胞突變、拷貝數改變、基因表達和甲基化等多組學數據，以及20個驅動基因中各個分子層面數據間的調控關系。本研究整合了食管鱗癌驅動基因的拷貝數變異信息、DNA甲基化和基因表達數據，分別進行突變與基因表達、拷貝數與基因表達和甲基化與基因表達的關聯分析，并結合患者的臨床資料進行生存分析，系統闡述了20個驅動基因在不同層面組學數據間的交互作用與潛在調控關系，為進一步闡明驅動基因在食管鱗癌發生、發展中的作用機制提供了思路。

對象與方法

1.研究對象：本研究所使用的91例食管鱗狀細胞癌患者的組織樣本均來自2010年～2014年在中國醫學科學院腫瘤醫院及浙江省腫瘤醫院接受手術治療的患者。所有患者未經過放射治療或化學藥物治療，以組織病理學診斷為最終判斷依據。患者的全部臨床信息及生存時間來自病歷記錄及定期隨訪。所有患者均簽署了知情同意書。本研究通過了中國醫學科學院腫瘤醫院及浙江省腫瘤醫院倫理學審查委員會的批準。

2.數據來源：患者體細胞突變、拷貝數改變及基因表達數據來自本組前期研究[14]。DNA甲基化數據通過Illumina 450K甲基化芯片檢測獲取。另外，利用TCGA 數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/tcga/)下載了95例食管鱗癌患者的體細胞突變、拷貝數改變、Illumina 450K甲基化芯片和轉錄組數據及相關臨床資料。Illumina 450K芯片的探針注釋文件來自ENCODE (http://genome.ucsc.edu/ENCODE/downloads. html)。

3. 數據分析：體細胞突變與驅動基因表達水平的比較分析，根據某個驅動基因在人群中是否存在突變，將患者分為突變組和非突變組，并分析20個驅動基因的表達水平在兩組間的差異。表達差異倍數(fold change, FC)定義為突變組的表達水平比非突變組的表達水平。拷貝數改變與驅動基因表達水平的關聯分析，通過Spearman秩相關分析鑒別驅動基因拷貝數改變與基因表達水平之間的關聯，當Spearman相關系數 |r|>0.3 時認為存在相關。DNA甲基化與驅動基因表達水平的關聯分析，通過Spearman秩相關分析，鑒別基因上甲基化位點的甲基化水平與基因表達之間的關聯。若甲基化位點位于啟動子區域，且Spearman相關系數r<-0.3時認為存在相關；若甲基化位點位于基因體區域，且Spearman相關系數r>0.3時認為存在相關。

4.統計學方法：應用R軟件(3.5.1版)對數據進行統計分析。體細胞突變與驅動基因表達水平的關聯分析采用非配對t檢驗。拷貝數改變、DNA甲基化與驅動基因表達水平的關聯分析采用Spearman秩相關。采用KaplanMeier法繪制生存曲線，通過Log-Rank檢驗進行生存曲線的比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.體細胞突變與驅動基因表達水平的關聯分析：根據各個驅動基因突變與否將患者分為突變組與非突變組，并對兩組患者基因表達水平進行比較。結果顯示，CDKN2A突變組患者表達水平顯著高于非突變組(FC=7.73,P=0.002)，而RB1突變組患者表達水平則顯著低于非突變組(FC=0.46,P=0.002)。另外，TCGA數據分析結果顯示，TP53(FC=1.70,P=0.018)和ZNF750(FC=2.31,P=0.026)突變組患者表達水平均顯著高于非突變組。最后，將兩部分數據合并后進行分析，TP53(FC=1.43,P=0.011, 圖1A)、RB1(FC=0.44,P=0.045, 圖1B)和ZNF750(FC=2.20,P=0.012, 圖1C)的表達差異有統計學意義，同時還發現PTCH1(FC=2.62,P=0.011, 圖1D)突變組表達顯著高于非突變組。

圖1 驅動基因突變組與非突變組中基因表達水平*P<0.05

2.拷貝數改變與驅動基因表達水平的關聯分析：對20個驅動基因的拷貝數和表達水平進行關聯分析，以鑒別拷貝數變異與驅動基因轉錄水平的相關程度。10個驅動基因的表達水平與其拷貝數改變呈顯著正相關(r>0.3,P<0.05)，其中PTEN、CUL3、PIK3CA和FAT1的相關系數明顯高于其他基因(r>0.5)。在TCGA數據中進行關聯分析，結果顯示大部分驅動基因(n=14，表1)的表達水平與其拷貝數呈正相關(r>0.3,P<0.05)，其中5個驅動基因(CDKN2A、PIK3CA、FBXW7、CUL3、RBPJ)的相關系數明顯高于其他基因(r>0.5)。8個驅動基因的表達水平在兩部分數據中均與拷貝數改變呈顯著正相關。

表1 拷貝數改變與表達水平呈顯著正相關的驅動基因

3.DNA甲基化與驅動基因表達水平的關聯分析：共發現11個驅動基因表達與其啟動子區甲基化呈負相關(r<-0.3,P<0.05)，6個驅動基因表達與基因體甲基化呈正相關(r>0.3,P<0.05,表1)。CDKN2A、FBXW7、CUL3、FAT1和PTCH1的表達同時受到啟動子和基因體甲基化的協同調節。另外，與本研究結果不同，TCGA數據分析結果顯示KDM6A、NOTCH3和RBPJ的基因表達受到啟動子和基因體甲基化的共同調控(表1)。這些結果揭示了啟動子和基因體甲基化在食管鱗癌驅動基因轉錄調控網絡中可能存在協同作用。

4.驅動基因相關生存分析：兩組患者Kaplan-Meier生存曲線比較，CREBBP突變組患者的生存時間顯著短于非突變組患者(P=0.029)，中位生存時間分別為11和19個月。TCGA數據中驅動基因生存分析的結果顯示，CREBBP突變組患者的生存時間同樣較短(中位生存時間為9和29個月，P=0.000)，并且FAT1突變組患者生存情況明顯較差(中位生存時間為12和29個月，P=0.005)。為了進一步驗證上述結果，筆者將兩部分數據合并進行生存分析，結果同樣發現CREBBP(中位生存時間為10和25個月，P=0.000，圖2)和FAT1(中位生存時間為14和26個月，P=0.002，圖3)突變組患者的生存情況較差。

圖2 CREBBP突變組與非突變組患者生存曲線比較

圖3 FAT1突變組與非突變組患者生存曲線比較

討 論

本研究利用本組和TCGA的多組學數據，將食管鱗癌驅動基因的體細胞突變、拷貝數改變、基因表達和DNA甲基化等多個分子層面的數據整合起來進行關聯分析。通過體細胞突變與驅動基因表達的關聯分析，結果顯示TP53、RB1、ZNF750和PTCH1的表達水平在兩組間比較差異有統計學意義。為了探究食管鱗癌發生、發展過程中的異常甲基化改變對驅動基因轉錄調控的影響，筆者對單個位點甲基化與對應驅動基因表達水平進行關聯分析。考慮到不同區域DNA甲基化調控基因表達的差異，筆者分別針對啟動子區域和基因體區域的關聯進行篩選[15-17]。ZNF750是一種譜系特異的轉錄因子，與其他轉錄因子共同參與鱗狀細胞分化的調控[18, 19]。這一結果提示驅動基因突變不僅可以通過影響編碼蛋白的功能參與異常信號網路的調控，而且可能通過調節其轉錄參與食管鱗癌的發生、發展。

通過拷貝數改變與基因表達的關聯分析中8個驅動基因的表達水平均與其拷貝數改變呈顯著正相關，并在兩組數據中比較差異均有統計學意義，其中CUL3和RBPJ的敲降可以顯著增加食管鱗癌細胞的增殖和遷移等[14]。FAT1和MLL2的拷貝數僅在本研究數據中與表達呈正相關，而NFE2L2等6個驅動基因表達水平僅在TCGA數據中與其拷貝數呈顯著正相關。NFE2L2是抗氧化信號通路的重要成員，其編碼蛋白NRF2可以激活多個控制氧化應激基因的轉錄，該基因的突變還與食管鱗癌患者的不良預后和化療抵抗相關[20, 21]。

此外，本研究通過DNA甲基化與基因表達水平的關聯分析，探究了甲基化在驅動基因轉錄調控中的貢獻。已有的食管鱗癌甲基化報道僅關注啟動子區甲基化與基因表達間的調控關系[22, 23]。筆者同時考慮了啟動子和基因體甲基化對基因表達的調控作用，在本研究數據中發現CDKN2A、FBXW7、CUL3、FAT1和PTCH1的表達與啟動子和基因體的甲基化均顯著相關，而TCGA數據中僅發現KDM6A、NOTCH3和RBPJ。這表明食管鱗癌驅動基因表達可能受到啟動子甲基化、基因體甲基化或二者的共同調控。

最后，本研究結果顯示CREBBP和FAT1突變均與患者的預后相關，可能作為食管鱗癌潛在的預后標志物。CREBBP是KAT3家族主要的賴氨酸乙酰轉移酶，可以作為許多信號通路的轉錄共激活因子[24, 25]。FAT1在多個發育過程中十分重要，其異常失活會導致多種腫瘤中Wnt信號通路的異常激活[26]。

綜上所述，本研究通過20個驅動基因多組學數據的整合分析，闡明了食管鱗癌驅動基因多個分子層面的異常改變以及它們間的交互作用。通過生存分析，本研究還鑒別了兩個潛在的食管鱗癌預后標志物，為臨床患者的預后判斷和分層治療提供了幫助。