白藜蘆醇治療膿毒癥大鼠急性肺損傷的作用及機制研究

鄭鳳霞 劉 迪 張莉紅

膿毒癥(sepsis)是臨床常見的急危重癥，急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是膿毒癥最常見的伴發癥[1]。炎性因子的大量激活是膿毒癥患者器官損傷的主要機制，急性肺損傷也與炎性因子的過度激活密切相關[2]。抑制炎性反應可以保護膿毒癥大鼠的肺功能已被研究所證實[3]。核因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路是膿毒癥炎性因子激活釋放的主要調節通路[4]。白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗炎、抗氧化的作用，可以作為動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑[5]。實驗研究觀察到白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷具有治療作用[6]，本研究觀察白藜蘆醇對對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用，并探討NF-κB炎性通路在其中的可能作用。

材料和方法

1.實驗動物:健康雄性SD大鼠購自華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心，體質量210～240g(2月齡)，共 80只，在動物中心清潔級適應性喂養3天后，進行后續實驗造模和研究。

2.膿毒癥造模：80只SD大鼠隨機分為假手術組(20只)和造模組(60只)，盲腸結扎穿刺術制作膿毒癥大鼠實驗模型。簡述如下：備皮消毒后，30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1.5cm切口，找到盲腸，游離腸系膜，距盲腸末端1/3處用 4 號手術線結扎，穿刺盲腸腸管，將盲腸還納腹腔，關閉腹腔，術后皮下注射0.9%NaCl注射液抗休克治療。20只假手術組大鼠僅僅分離盲腸，不做結扎和穿孔。造模組SD大鼠術后12h開始出現豎毛、蜷縮、少動、精神倦怠、少食、腹瀉、眼角滲出物等表現，成功率100%。術后60只造模SD 大鼠隨機分為膿毒癥模型組、低劑量白藜蘆醇干預組(Rec，20mg/kg)和高劑量白藜蘆醇干預組(Rec，40mg/kg)，每組20只，白藜蘆醇干預組大鼠于術后60min按照分組分別尾靜脈注射無菌白藜蘆醇(20mg/kg或40mg/kg，美國Sigma公司產品)，假手術組和膿毒癥模型組大鼠尾靜脈注射等量0.9%NaCl注射液。24h后進行相關指標檢測。

3.腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)的ELISA法檢測:大鼠外周血TNF-α、IL-6的表達的ELISA法檢測。ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物科技技術有限公司(批號：20180732)，造模前和造模24h后抽取大鼠尾靜脈血液0.4ml，交由檢驗科嚴格按照試劑盒說明書操作，加入相關試劑，上海巴玖實業有限公司SAF-680T酶標儀檢測各樣品的吸光度值變化，對照標準品，計算各樣品TNF-α和IL-6的表達水平。

4.肺損傷評分:造模24h后，所有大鼠均斷頸處死，取左肺下葉組織，4%甲醛固定肺組織24h后，送病理科制作HE染色切片，鏡下見肺組織血管充血，間質水腫出血，肺泡壞死，肺泡腔范圍消失，淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤[7]。顯微鏡下進行肺損傷評分，按照正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)從肺泡水腫、肺泡出血、肺不張、炎性細胞浸潤、透明膜形成5個方面進行評分，總分15分，評分越高損傷越嚴重[8]。

5.肺組織細胞核P65的Western blot法檢測：造模24h后，所有大鼠均斷頸處死，取50mg左肺下葉組織，液氮下研磨后，PBS洗滌2次，細胞核蛋白提取試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司(批號：20180321)，嚴格按照試劑盒說明書操作，提取細胞核蛋白，加入蛋白裂解液，取10μg核蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后電轉至PVDF膜，加入兔抗鼠P65抗體(武漢博士德生物科技技術有限公司，批號：20180716)孵育12h，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗(武漢博士德生物科技技術有限公司，批號：20180227)，化學發光后使用上海金鵬公司生產JP-K300型化學發光成像系統拍照，Quantity One V4.3.0軟件，掃描條帶，以組蛋白為內參計算各樣品的相對表達量。同一大鼠在不同部位取材3次，實驗重復3次，然后求平均值。

6.統計學方法：采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料采用t檢驗，多組均數比較使用方差分析，組間相互比較使用LSD-t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠存活率的影響:假手術組無大鼠死亡，存活率為100.0%，膿毒癥模型組死亡9只，存活11只，存活率為55.0%，低劑量Rec干預組死亡5只，存活15只，存活率為75.0%，高劑量Rec干預組死亡2只，存活18只，存活率為90.0%，4組間存活率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中低劑量和高劑量Rec干預組存活率顯著高于膿毒癥模型組(P<0.05)，高劑量Rec干預組存活率顯著高于低劑量Rec干預組(P<0.05)。

2.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠肺組織損傷的影響:肺損傷評分在假手術組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預組和高劑量Rec干預組分別為1.04±0.22分、12.25±2.14分、8.63±1.36分和5.18±1.13分，4組比較,差異有統計學意義(P<0.01)，其中低劑量和高劑量Rec干預組肺損傷評分顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預組肺損傷評分顯著低于低劑量Rec干預組(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 4組造模24h后肺損傷評分的比較與假手術組比較，*P<0.01；與膿毒癥模型組比較，▲P<0.01；與低劑量Rec干預組比較，#P<0.01

3.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠TNF-α、IL-6炎性因子表達的影響:假手術組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預組和高劑量Rec干預組造模前大鼠外周血TNF-α和IL-6表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，造模24h后低劑量和高劑量Rec干預組TNF-α和IL-6表達顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預組TNF-α和IL-6表達顯著低于低劑量Rec干預組(P<0.01)，詳見表1。

表1 4組TNF-α和IL-6表達的比較

與假手術組比較，*P<0.01；與膿毒癥模型組比較，▲P<0.01;與低劑量Rec干預組比較，#P<0.01；與造模前比較，&P<0.05，&&P<0.01

4.白藜蘆醇對膿毒癥模型大鼠肺組織細胞核P65的表達：肺組織細胞核P65相對灰度值在假手術組、膿毒癥模型組、低劑量Rec干預組和高劑量Rec干預組分別為0.14±0.03、0.82±0.15、0.56±0.09、0.25±0.06，各組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。其中假手術組肺組織細胞核P65表達顯著低于低劑量和高劑量Rec干預組(P<0.01)，低劑量和高劑量Rec干預組P65表達顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)，高劑量Rec干預組P65表達顯著低于低劑量Rec干預組(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 4組大鼠肺組織細胞核P65表達的Western blot法檢測

討 論

膿毒癥是臨床上的急危重癥，急性肺損傷是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，20%的急性肺損傷是伴發于膿毒癥患者，其病死率高達50%～70%[9]。膿毒癥激發的全身炎性反應綜合征是導致多器官功能障礙的重要原因，研究已發現膿毒癥急性肺損傷患者體內炎性反應的激活[10]。NF-κB信號通路是機體內一條重要的炎性調節通路，在膿毒癥時處于激活狀態，并且可以參與到肺損傷的致病過程中[11，12]。王國全等[13]研究證實抑制NF-κB信號通路可以對膿毒癥急性肺損傷大鼠發揮保護作用。白藜蘆醇是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，其抗炎作用已被大多數實驗所證實[14]。于紅等[15]研究顯示，白藜蘆醇可以顯著降低內質網應激和血管內皮損傷標志蛋白的表達，對急性肺損傷小鼠發揮保護作用。本研究也觀察到白藜蘆醇干預組肺損傷評分顯著低于膿毒癥模型組，說明膿毒癥時給予白藜蘆醇對模型鼠肺組織具有保護作用。

NF-κB信號通路中的主要效應蛋白是P65和P50，二者形成二聚體進入細胞核發揮轉錄因子的作用，調節下游炎性因子例如TNF-α和IL-6 等的表達[16]。因此研究中檢測細胞核中P65蛋白的表達就可以反應出NF-κB信號通路的激活情況[17]。本研究的檢測顯示模型組大鼠肺組織細胞核P65表達顯著高于假手術組，其中白藜蘆醇干預組肺組織細胞細胞核P65表達顯著低于非干預的膿毒癥模型組，說明白藜蘆醇抑制了NF-κB信號通路中關鍵蛋白P65的核移位，下游的炎性因子TNF-α和IL-6在相應的在白藜蘆醇干預組也顯著低于非干預的膿毒癥模型組。楊劍榆等[18]的研究也發現白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB活性減輕大鼠腸缺血再灌注模型中繼發的肺損傷，綜合上述研究提示白藜蘆醇對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用可能是通過調節NF-κB通路來實現的，但是其具體的機制還需要開展進一步實驗來證實。

綜上所述，本研究顯示白藜蘆醇下調膿毒癥大鼠肺組織細胞核P65蛋白的表達，抑制炎性反應，對肺損傷具有保護作用。