慢病毒介導長鏈非編碼RNA BACE2-IT1過表達抑制胃癌細胞的增殖和侵襲

楊杰智 徐 倩 楊明月 呂紅瓊 黃 靜

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發生率和病死率在我國位居第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。胃癌的早期癥狀并不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，手術治療以及放療、化療的效果并不理想，臨床迫切需要基因靶向治療、免疫療法等新興治療方法[2]。人類細胞長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200nt的內源性單鏈RNA，本身不具有編碼蛋白的功能[3]。lncRNA可在轉錄、轉錄后等多個水平調控基因的表達，與腫瘤細胞的活動密切相關, 在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、轉移等惡性生物學行為中發揮重要的調控作用，參與腫瘤的發生、發展[4, 5]。越來越多的lncRNA被歸類為抑癌基因或癌基因[6]。BACE2-IT1是一種長度為382nt的lncRNA，其在細胞特別是腫瘤細胞中的作用未見報道。本研究通過檢測BACE2-IT1在胃癌組織和胃癌細胞株中的表達，并以胃癌細胞株為研究對象進行體外研究, 探討BACE2-IT1對胃癌細胞增殖和侵襲的影響及其可能的分子機制, 為lncRNA的分子靶向治療提供一定理論和實驗依據。

材料與方法

1.實驗材料： 收集2017年1月～2018年9月筆者醫院行手術切除治療的胃癌臨床標本26例，包括胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣超過5cm)，術后標本均經病理醫生確認無誤，研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準, 參與患者均簽署知情同意。載有BACE2-IT1的慢病毒和空載慢病毒由上海漢恒科技有限公司合成；人胃癌細胞株MGC803、BGC-823、SGC7901、HS-746T、AGS和永生化胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基、RPMI-1640培養基、小牛血清均購自美國Gibco公司；實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購自大連寶生物試劑公司；CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Costar公司；抗體(HACE1、Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC、α-Tubulin)、Matrigel基質膠購自美國BD公司； qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.細胞培養與慢病毒感染：人胃癌細胞株MGC803、BGC-823、SGC7901、AGS和永生化胃黏膜上皮細胞GES-1復蘇后，培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，胃癌細胞株HS-746T復蘇后，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中。收集對數期生長的BGC-823細胞，接種于6孔細胞板。待細胞融合度為60%，以感染復數(MOI)=40將慢病毒顆粒液體感染BGC-823細胞，加10μmol/ml聚凝胺以增加感染效率，24h后觀察細胞狀態并更換新鮮培養基。

3.實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測BACE2-IT1和HACE1 mRNA的表達：Trizol法提取胃癌組織和胃癌細胞株總RNA，檢測RNA濃度和純度后，反轉錄合成cDNA后行qPCR檢測。qPCR反應條件:95℃預變性8min, 95℃變性1min, 56℃退火30s, 72℃延伸1min, 共35個循環。數據采用2-ΔΔCt方法進行處理，以GAPDH為內參基因，檢測組織或細胞中BACE2-IT1和HACE1 mRNA的相對表達量。GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；BACE2-IT1上游引物：5′-GCTAGTGCTCAGTTTGGTCTGA-3′，下游引物：5′-GCTCCTTAGATCAGGTATCCAGAG-3′；HACE1上游引物：5′-AGTTGCCCGAGGATAATGAAAC-3′，下游引物：5′-TCCACCGATCCACAATTTGCT-3′。

4.CCK-8檢測感染后BGC-823細胞的增殖能力：將感染后的BGC-823細胞按5×103個/孔接種于96孔板，每組平行4個孔。CCK-8檢測方法：每孔加5mg/ml的CCK-8試劑10μl，繼續在培養箱內培養4h，棄去培養基，每孔加150μl二甲基亞砜，采用SpectraMax plus384型全波長酶標儀檢測每孔在波長450nm處的吸光度(A)值。連續檢測5天，繪制細胞生長曲線。

5.Transwell侵襲實驗檢測感染后BGC-823細胞的侵襲能力：采用RPMI-1640培養基稀釋Matrigel基質膠，平鋪至Transwell小室上室內，培養箱內凝固1h。將感染后的BGC-823細胞消化、離心收集，采用RPMI-1640培養基重懸并調整細胞濃度為2×105個/毫升。均勻加入200μl細胞懸液至Transwell小室上室，加入含10%FBS的RPMI-1640培養基600μl至Transwell小室下室，在培養箱中培養24h。取出Transwell小室上室，棉簽擦去上室未穿膜的細胞, PBS溶液漂洗，采用多聚甲醛固定25min，吸去固定液，采用0.1%的結晶紫染液染色25min，PBS溶液漂洗3次,晾干后在倒置顯微鏡下, 每組隨機選4個視野計數穿膜細胞數并取平均值。

6．蛋白質印跡法(Western blot法)：將感染后的BGC-823細胞采用細胞裂解液裂解并提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒分析蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉1h。加入一抗HACE1(1∶1000稀釋)、Wnt(1∶2000稀釋)、β-catenin(1∶500稀釋)、GSK-3β(1∶2000稀釋)、APC(1∶2000稀釋)、α-Tubulin(1∶3000稀釋)， 4℃下孵育過夜，加入二抗在室溫下孵育1h。滴加ECL顯影液至條帶，采用凝膠成像系統顯影并拍照。

結 果

1.BACE2-IT1在胃癌組織中的表達：qPCR結果顯示BACE2-IT1在胃癌組織和癌旁組織中的表達分別為1.34 ± 0.35和5.66 ± 1.09，BACE2-IT1在胃癌組織中低表達，詳見圖1。

圖1 BACE2-IT1在胃癌組織和癌旁組織中的表達

2.BACE2-IT1在胃癌細胞中的表達：qPCR結果顯示BACE2-IT1在MGC803、BGC-823、SGC7901、AGS細胞株和永生化胃黏膜上皮細胞GES-1中的表達量分別為0.51±0.05、0.10±0.01、0.81±0.03、0.69±0.06、0.35±0.03和1.00±0.04，與永生化胃黏膜上皮細胞GES-1比較，BACE2-IT1在胃癌細胞株中表達下調，差異有統計學意義(P均<0.01)。BACE2-IT1在BGC-823細胞表達降低最明顯(P<0.01)，故以BGC-823細胞為對象進行研究，詳見圖2。

圖2 BACE2-IT1在永生化胃黏膜上皮細胞株和胃癌細胞株中的表達與GES-1細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.qPCR檢測感染后BGC-823細胞中BACE2-IT1的表達：qPCR結果顯示，對照組和實驗組胃癌BGC-823細胞中BACE2-IT1的表達分別為1.07±0.23和8.08±0.63，差異有統計學意義(P<0.01)，證明外源性BACE2-IT1在BGC-823細胞中成功表達。

4．BACE2-IT1對胃癌BGC-823細胞增殖能力的影響：采用CCK-8法檢測BACE2-IT1過表達對 BGC-823細胞增殖能力的影響，結果顯示，與對照組比較，實驗組BGC-823細胞從第2天開始，細胞增殖能力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 BACE2-IT1過表達對胃癌BGC-823細胞增殖能力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.BACE2-IT1對胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響：采用Transwell侵襲實驗檢測BACE2-IT1過表達對 BGC-823細胞侵襲能力的影響，對照組和實驗組BGC-823穿膜細胞數分別為87.82±9.57和36.65±5.78，差異有統計學意義(P<0.01)，證明BACE2-IT1過表達能抑制胃癌細胞BGC-823的侵襲能力，詳見圖4。

圖4 BACE2-IT1過表達對胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響

6.qPCR檢測感染后BGC-823細胞中HACE1 mRNA的表達：qPCR結果顯示，對照組和實驗組胃癌BGC-823細胞中HACE1 mRNA的表達分別為1.01±0.09和4.31±0.52，差異有統計學意義(P<0.01)，證明BACE2-IT1過表達可上調BGC-823細胞中HACE1 mRNA的表達。

7.BACE2-IT1過表達對胃癌BGC-823細胞HACE1蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響：Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，實驗組的 HACE1蛋白表達上調，而Wnt/β-catenin信號通路蛋白Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC表達下調，詳見圖5。

圖5 BACE2-IT1過表達對胃癌BGC-823細胞中HACE1蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響

討 論

胃癌在我國的發生率和病死率呈迅速上升趨勢，嚴重威脅人群健康，分子靶向治療研究是胃癌治療研究領域的熱點[7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類具有組織特異性的非編碼RNA，大多數lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成[8]。lncRNA可參與染色質核內運輸以及原癌基因活化等重要過程，在多種癌癥如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等中發揮癌基因或者抑癌基因的角色，lncRNA具有成為可靠生物學標志物和治療靶點的潛力[9～12]。近年來的大量研究表明，lncRNA的異常表達與胃癌的發生、發展密切相關[13]。lncRNA如ZFPM2-AS1、MAP3K20、TP73-AS1、GACAT3在胃癌組織和細胞株中過表達，與胃癌的不良預后密切相關，促進胃癌的惡性生物性行為[14～16]。lncRNA如LINC00675在胃癌組織和細胞株中低表達，參與抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲，與胃癌的病理特征和預后等密切相關[17]。BACE2-IT1是一個新發現的lncRNA，BACE2-IT1在胃癌中的表達模式、作用機制尚不清楚。

本研究檢測BACE2-IT1在胃癌中的表達模式發現，BACE2-IT1在胃癌組織和細胞株中明顯低表達，提示BACE2-IT1可能在胃癌中發揮抑癌基因作用。本研究進一步通過CCK-8實驗和Transwell侵襲實驗發現，BACE2-IT1過表達可明顯抑制胃癌細胞BGC-823的增殖能力和侵襲能力，進一步提示BACE2-IT1在胃癌中發揮抑癌基因作用。HECT家族E3泛素連接酶1(HACE1)是E3泛素接酶HECT家族成員之一，位于6q21染色體[18]。HACE1在結直腸癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中低表達，HACE1過表達可抑制腫瘤的生長和轉移，是一種潛在的抑癌基因[18]。有研究表明，與癌旁組織比較，胃癌組織中HACE1的表達顯著降低；HACE1的表達水平與胃癌的病理分級、分期呈負相關；HACE1過表達在體內和體外均可明顯抑制胃癌的生長和轉移[19]。本研究通過qPCR和Western blot法驗證，BACE2-IT1在胃癌細胞BGC-823中過表達后，HACE1基因的表達明顯上調，表明BACE2-IT1可促進HACE1基因的表達。HACE1主要通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，干擾腫瘤的生長和轉移[19]。Western blot法檢測結果顯示，胃癌細胞BGC-823中HACE1基因表達上調后，Wnt、β-catenin、GSK-3β、APC等Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達明顯降低，Wnt/β-catenin信號通路的活化被抑制。

綜上所述，本研究驗證BACE2-IT1在胃癌組織和胃癌細胞株中的表達減少，BACE2-IT1過表達能抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，其分子機制可能是BACE2-IT1正調控對HACE1的表達并抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，為探索胃癌的發生機制以及發現分子治療靶點提供理論依據。BACE2-IT1調控HACE1基因表達的作用機制仍不明確，是今后研究的重點。