免疫熒光法在微生物快速檢驗中的應(yīng)用分析

黃智明

【摘要】 目的 探討免疫熒光法在微生物快速檢驗中的應(yīng)用價值。方法 150例確診為上呼吸道感染患者， 對所有患者的鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗， 觀察分析所有患者的病毒感染率與病毒感染種類。結(jié)果 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。結(jié)論 免疫熒光法可快速檢驗上呼吸道感染患者病毒感染率與病毒感染種類， 可作為患者疾病進(jìn)展與預(yù)后判斷的參考依據(jù)， 推薦臨床廣泛應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 免疫熒光法;微生物;快速檢驗;上呼吸道感染

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.044

免疫熒光技術(shù)是結(jié)合免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)來研究特異性蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布情況的一種研究技術(shù)， 主要是由于熒光素所散發(fā)出來的熒光可被熒光顯微鏡檢出， 進(jìn)而可對抗原進(jìn)行精準(zhǔn)的細(xì)胞定位[1]。此方法不僅檢驗速度快， 而且敏感度與特異度均較高， 現(xiàn)已成為診斷學(xué)中最常用的方法之一， 臨床常將其應(yīng)用于細(xì)菌、真菌以及病毒等微生物的快速檢驗中， 且取得了滿意效果[2]。臨床發(fā)現(xiàn)， 大部分的上呼吸道感染是由病毒感染引起， 常見病毒包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及呼吸道合胞病毒等[3]。準(zhǔn)確地診斷致病病毒類型， 再給予針對性治療對患者預(yù)后改善具有重要意義。本研究選取了150例上呼吸道感染患者， 對其鼻、咽喉分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗， 具體報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2018年1月～2019年1月本院收治的150例確診為上呼吸道感染患者作為本次研究對象， 其中男84例， 女66例;年齡12～77歲， 平均年齡（47.52±16.48）歲;身高155～192 cm， 平均身高（168.62±8.25）cm;體重43～95 kg，?平均體重（65.83±9.73）kg;文化程度：大專及以上25例， 高中48例， 初中53例， 小學(xué)及以下24例;疾病類型：鼻部感染65例， 咽部感染55例， 喉部感染30例;合并癥：急性心肌炎11例， 風(fēng)濕熱6例， 腎炎5例。

1. 2 方法

1. 2. 1 試劑 使用美國DHI公司生產(chǎn)的熒光檢測試劑盒， 具體包含熒光標(biāo)志單克隆抗體試劑盒與熒光標(biāo)志抗體試劑盒， 主要是針對流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型試劑盒;另外， 還有封閉液、濃縮型洗滌液以及病原體對照載玻片。

1. 2. 2 快速檢驗方法 ①標(biāo)本收集和處理：a.使用負(fù)壓吸引器取患者2～3 ml的鼻、咽及喉部分泌物， 然后將分泌物放置無菌生理鹽水中待檢。b.對分泌物進(jìn)行反復(fù)性地吹打， 然后放置于離心管內(nèi)。c.將分泌物離心， 控制轉(zhuǎn)速為500 r/min， 離心時間為8 min， 除去上清液。d.將遺留下來的沉淀物使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌， 然后混合均勻。e.對沉淀物再次進(jìn)行離心處理， 除去上清液， 重復(fù)多次， 直至上清液不再粘稠為止。f.將最后遺留的沉淀物溶解在0.5～1.0 ml的磷酸鹽緩沖液中， 再進(jìn)行反復(fù)吹打， 直至其成為細(xì)胞懸液為止。g.將細(xì)胞懸液點(diǎn)在病原體對照載玻片上， 保持每孔25 μl。h.風(fēng)干點(diǎn)樣孔， 然后使用冷丙酮對其進(jìn)行固定10 min， 待檢。②熒光染色：a.于對照載玻片樣孔內(nèi)細(xì)胞中滴入20 μl對應(yīng)熒光抗體， 然后在37℃的保溫盒內(nèi)孵育30 min， 也就是在1～7號樣孔內(nèi)一次性地滴入熒光標(biāo)志抗體進(jìn)行陰性對照， 而采用熒光標(biāo)志單克隆抗體作為陽性對照， 以流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型試劑盒作為樣品孔。b.使用濃縮型洗滌液對載玻片內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌， 然后使用蒸餾水充分洗滌1 min。c.等待蒸餾水完全風(fēng)干之后， 在載玻片孔內(nèi)再滴入1滴封閉液， 然后將蓋玻片蓋好， 最后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1. 3 診斷原則與陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) ①診斷原則：當(dāng)被熒光標(biāo)志的對應(yīng)病毒特異性單克隆抗體與其抗原相互結(jié)合之后， 形成了一種結(jié)合復(fù)合物， 使用熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)為綠色熒光， 但未被染色的會被Evas藍(lán)染而成為紅色。②陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：若熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光代表陽性， 若無熒光代表陰性;若熒光顯微鏡放大200倍時， 發(fā)現(xiàn)不低于2個熒光細(xì)胞則代表陽性。

2 結(jié)果

150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。見表1。

3 討論

上呼吸道感染是鼻腔、咽部及喉部急性炎癥的總稱， 從廣義角度來說， 其不是一個疾病診斷， 而屬于一組疾病， 包含普通感冒、咽結(jié)膜熱、病毒性咽炎、喉炎、細(xì)菌性咽-扁桃體炎以及皰疹性咽峽炎等;從狹義角度來說， 也被成為普通感冒， 屬于臨床最常見的一種急性呼吸道感染疾病， 具有發(fā)病率高、自限性等特點(diǎn)[4， 5]。本研究采用免疫熒光法對150例上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢驗， 結(jié)果顯示， 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。可見對上呼吸道感染患者的鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行檢驗， 可快速、準(zhǔn)確地檢驗患者感染率與感染病毒的種類， 效果較為可靠。免疫熒光法使用的試劑是患者的血清與其免疫熒光抗體， 此檢驗要求試劑要對關(guān)鍵部分抗體有著較高的特異性， 也就是單特異性抗體制劑[5]。近些年來， 隨著人工合成免疫原技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步， 研究發(fā)現(xiàn)， 沙門氏菌群的特異性抗原決定簇屬于一種雙糖， 所以很多研究者首先采用人工合成法對這種雙糖進(jìn)行高濃度地合成， 然后再將其與蛋白質(zhì)結(jié)合， 形成一種免疫原， 最后便可合成群特異性較強(qiáng)的單特異性抗體[7]。近年來新發(fā)展而成的單克隆抗體制備技術(shù)也為單特異性抗體的制備奠定堅實的基礎(chǔ)。

免疫熒光法的技術(shù)原理是依據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理， 把已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素再制備成一種熒光標(biāo)記物， 然后使用此類熒光抗體（或抗原）作為分子探針對細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗體（或抗原）進(jìn)行檢驗[8];由于在細(xì)胞或組織內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物表層含有熒光素成分， 當(dāng)使用熒光顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察時， 熒光素在激發(fā)光照射下會發(fā)出亮度較大桔紅色或黃綠色的熒光， 同時也可觀察到熒光所在細(xì)胞或組織的具體位置， 進(jìn)而準(zhǔn)確地判斷出抗原或抗體的性質(zhì)、定位， 最后采用定量技術(shù)對其含量進(jìn)行準(zhǔn)確地測定[9]。目前， 臨床將免疫熒光技術(shù)分為熒光抗體法與熒光抗原法兩種， 其中應(yīng)用熒光抗體示蹤或檢驗相應(yīng)抗原法稱為熒光抗體法;應(yīng)用已知熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢驗相應(yīng)抗體法稱為熒光抗原法， 前者相對而言較為常用。另外， 臨床將應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察與檢驗細(xì)胞、組織中抗原或半抗原物質(zhì)的方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)， 而免疫熒光細(xì)胞化學(xué)又分為直接法、間接法、補(bǔ)體法以及夾心法等[10]。本研究應(yīng)用免疫熒光法檢驗上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物標(biāo)本僅需在實驗室2 h內(nèi)， 并借助熒光顯微鏡以及相應(yīng)試劑盒便可檢驗出150例上呼吸道感染患者的病毒感染率與病毒感染類型， 操作簡單、成本低廉， 可在一般實驗室內(nèi)開展， 開展局限性較小。雖本研究結(jié)果顯示免疫熒光法檢驗上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本的效果較好， 但由于本研究所收集的病例數(shù)量較少， 所得研究結(jié)果可能會存在一定偏倚， 因此臨床還需擴(kuò)大研究規(guī)模進(jìn)行進(jìn)一步探究， 且還需對其他微生物感染類疾病采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗， 以驗證其檢驗效果。

綜上所述， 免疫熒光法可快速檢驗上呼吸道感染患者病毒感染率與病毒感染種類， 可作為患者疾病進(jìn)展與預(yù)后判斷的參考依據(jù)， 推薦臨床廣泛應(yīng)用。

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[收稿日期：2019-09-11]