HBV 相關肝細胞癌患者中LAIR-1 的表達變化及與T 細胞亞群和IL-10 的關系＊

薛國輝，孫亭立，王琴，淦勤，陳雪禮

（江西省九江市第一人民醫院，1.檢驗科；2.肝膽外科；3.體檢中心，九江332000）

肝細胞癌 （Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1,2]，亦是腫瘤相關死亡的主要原因之一，且其整體生存期較差，探究其病因學機理并找尋早期診斷標志物和新的治療靶點對于HCC 診療尤為重要。 流行病學數據顯示慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC 發生發展最關鍵的風險因素，其在HCC 病因學中扮演重要角色[3,4]。 全球范圍內約20 億人感染HBV, 3.5 億為HBV 攜帶者。 約15%-40%的HBV 感染者會發展為肝硬化、肝衰竭或HCC[5]。 慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）與HCC 發生發展存在顯著相關性,長期的炎癥刺激可導致正常肝臟細胞結構和功能的變化， 進而形成腫瘤[6]。基礎和臨床研究發現免疫平衡紊亂即免疫抑制效應主導在HBV 相關HCC 的啟動和進展中發揮關鍵生物學效應[7]。 白細胞相關免疫球蛋白樣受體1（Leukocyte -associated immunoglobulin - like receptor-1，LAIR-1）屬于免疫球蛋白超家族，是一類抑制性膠原受體，廣泛表達于多種免疫細胞，如T 細胞、B 細胞以及單核細胞等[8]，也可從細胞膜表面脫落至血清中成為可溶性LAIR-1。 先前研究發現其在上皮性卵巢癌、 宮頸癌以及口腔鱗癌患者中表達異常，且與腫瘤侵襲轉移相關。 然而關于其是否在HBV 相關HCC 患者循環外周血中存在異常，目前鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017 年7 月-2019 年10 月于九江市第一人民醫院肝膽外科就診且經病理組織學確診的HCC 患者31 例, 且病原學證實為HBV陽性，其中男18，女13 例,年齡38-66 歲,中位年齡52 歲。 診斷依據2014 版《肝細胞癌規范診治流程評價》[9],排除其他臟器嚴重疾病患者以及合并肝靜脈、下腔靜脈以及膽管癌等并發癥的患者。選取25例CHB 患者作為良性疾病對照組, 其中男16 例，女9 例，年齡36-65 歲,中位年齡52 歲；同時選取同期于本院體檢中心行健康體檢的人群25 例作為健康對照組（HC）,其中男17 例,女8 例,年齡37-69 歲,中位年齡53 歲。 對照組人群排除肝臟以及其他臟器嚴重疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病等。

1.2 標本采集及處理 抽取HCC 患者術前以及健康體檢者清晨空腹靜脈血各6ml， 平均分裝于2管。 其中一管于紅蓋干燥管中，室溫靜置20min 后4000rpm，10min 離心后分離血清于-80℃冰箱凍存，用于血清可溶性LAIR-1（sLAIR-1）以及白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）的測定。 另一管分裝于紫蓋EDTA 抗凝管中，立即送檢，用于流式細胞術檢測外周血T 細胞亞群， 在2h 內完成檢測。

1.3 試劑、 儀器及測定 試劑： 人LAIR-1 ELISA Kit（ No. ABIN417568）購自德國antibodies-online公司， 其測試線性范圍為0.31-20ng/ml。 人IL-10 ELISA Kit（D1000B）購自美國R&D 公司，其測試線性范圍為7.8-500pg/ml。人CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 T 細胞亞群檢測試劑盒（6607013）購自美國貝克曼庫爾特公司。 儀器：科華ST-360 酶標儀（上海科華生物工程股份有限公司）；FC500 貝克曼流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）。 測定： ⑴LAIR-1 和IL-10 測定嚴格依據ELISA 試劑盒說明說執行； ⑵T 細胞亞群測定：混勻外周血，取50μl 于流式檢測管底部，防止血液沾染管壁；加10μl T 細胞亞群混合抗體，混勻；室溫避光孵育15min； 加500μl 溶血劑室溫避光10min裂解紅細胞；1200rpm 5min 離心去上清； 加2ml PBS 混勻后，1200rpm 5min 離心去上清； 加500μl PBS 混懸后上機檢測。依據FSc-SSc 設門圈定淋巴細胞， 再逐步分析CD3+、CD3+CD4+以及CD3+CD8+細胞比例。

1.4 統計學分析 所有研究數據以SPSS 20.0 統計軟件和Graphad prism 8.0 軟件處理，Kolmogorov-Smirnov 法檢測數據的正態性； 符合正態分布的計量資料采用均數±標準差的形式表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t 檢驗，兩個以上樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數P50(P25,P75)形式表示，組間比較采用非參數檢驗。 計數資料采用百分數表示，組間差異采用卡方檢驗。 Spearman相關性用于分析各指標間的相關性。 以P<0.05（雙側）視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組人群sLAIR-1、T 細胞亞群以及IL-10 的差異 經KS 正態性分布檢驗顯示3 組人群sLAIR-1、T 細胞亞群以及IL-10 均符合正態分布，采用單因素方差分析比較組間差異， 結果顯示：sLAIR-1 在3 組人群間存在顯著差異，LSD 兩兩檢驗顯示HCC 患者sLAIR-1 濃度顯著高于CHB 和HC；IL-10 在HCC 患者中顯著上調， 而CHB 患者則顯著下降；HCC 患者CD3+CD4+T 比例顯著高于CHB 和HC；而CD3+CD8+T 比例在3 組間無顯著差異；CD4+T/CD8+T 比值在HCC 中顯著下降， 低于CHB 和HC。 見表1。

2.2 sLAIR-1 與HCC 臨床病理組織學參數間的關系 分別依照HCC 患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移與否、是否肝硬化以及TNM 分期將患者分組，進一步統計學分析血清sLAIR-1 的差異。 分析結果顯示血清sLAIR-1 在不同性別、 不同年齡以及腫瘤大小組間無統計學差異（P 均>0.05）。 進一步分析發現血清sLAIR-1 在淋巴結轉移患者中顯著高于未轉移患者； 在肝硬化患者中亦顯著高于未發生肝硬化的患者； 且晚期患者高于早期患者，見表2。

表1 3 組人群sLAIR-1、T 細胞亞群以及IL-10 的差異比較

表2 HCC 患者血清sLAIR-1 與臨床病理學參數間的關系

2.3 sLAIR-1 與T 細胞亞群以及IL-10 的相關性Spearman 相關性分析結果顯示HCC 患者血清sLAIR-1 與IL-10 濃度間呈顯著正相關性 （r=0.5105，P=0.0033）； 而與CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 以及CD4+T/CD8+T 間相關性均不顯著。

3 討論

雖然隨著外科手術以及化療技術等HCC 治療手段的不斷發展， HCC 患者生存期有所提升，但晚期患者往往喪失了手術機會以及不斷出現的化療耐受等現象導致腫瘤復發，最終治療失敗[2]。 發掘HCC 中的異常分子并弄清HCC 免疫學機理對于發掘新的生物標志物以及開發新的靶向治療方案尤為重要，目前國內外大量研究聚焦于此。

LAIR-1 自發現以來被認為主要表達于免疫細胞表面， 也表達于諸如CD34+造血祖細胞、MK細胞以及破骨細胞等其他類細胞表面[10]。 LAIR-1主要生物學功能為負性調控免疫反應和細胞分化， 此外作為膠原的配體其也可以調控膠原的代謝和沉積[11]。 其在腫瘤中的研究較少， 目前僅有Wang Y 等[12]發現在宮頸癌患者腫瘤組織中LAIR-1 高表達， 其表達情況與腫瘤進展相關。 此外，Yang LL 等[13]利用組織芯片發現口腔鱗癌患者組織中LAIR-1 異常高表達， 且與病理學分級相關。這與本研究中發現的HCC 患者sLAIR-1 升高且與淋巴結轉移以及TNM 分期密切相關的結果一致， 提示LAIR-1 亦可能參與了HCC 的發生發展過程。但在急性淋巴細胞白血病患者中Singh M 等學者利用流式細胞術發現LAIR-1 顯著低表達，這與Perbellini 等[14,15]在慢性淋巴細胞白血病患者中發現的結果類似。 這可能提示血液腫瘤患者LAIR-1 的表達由于血液細胞的變化而下降，這與實體腫瘤存在顯著區別。

此外，本研究還發現CHB 患者sLAIR-1 相較對照組亦顯著升高， 這可能提示LAIR-1 參與了HBV 與 肝 臟 的 炎 癥 反 應 過 程。 María Martínez-Esparza 等[16]學者就發現肝硬化患者外周血單核細胞表明LAIR-1 表達顯著上調，且在早期肝硬化患者中就已經出現異常高表達現象，表明LAIR-1 是肝硬化中慢性炎癥導致的肝損傷的新型生物標志物。這一結果連同本研究結果提示LAIR-1 可能參與了CHB-肝硬化-HCC 的全過程。另外，本研究還發現出現肝硬化的HCC 患者其sLAIR-1 顯著高于未出現肝硬化的HCC 患者。 既往研究報道多種腫瘤膠原表達顯著上調， 且與不良的臨床結局相關， 而膠原的過表達是通過LAIR-1 受體實現的。出現肝硬化的HCC 患者其膠原表達量更高， 因此可能伴隨了sLAIR-1 的高表達。 另外，相關性分析發現HCC 患者血清sLAIR-1 與免疫抑制性細胞因子IL-10 呈顯著正相關性， 但與CD3+T 細胞亞群相關性不顯著。Yang LL 在口腔鱗癌患者中也發現LAIR-1 與免疫抑制性細胞髓源性抑制細胞和抑制性免疫檢查點分子B7-H3 和VISTA 存在顯著相關性[14]。 這些結果提示LAIR-1 在HCC 中可能發揮免疫抑制效應。

總之，本研究初步發現HCC 患者血清sLAIR-1 異常上調，并與腫瘤分期及是否發生肝硬化存在關聯， 且與免疫抑制性細胞因子IL-10 顯著相關，提示其可能參與HCC 的發生發展過程。