CyclinD1、VEGF 及EGFR 在結直腸癌中的表達及臨床意義＊

胡佳莉，陳丕峰，葉萍，張小容

（1.九江學院附屬醫(yī)院，九江332000；2.江西省九江市婦幼保健院兒外科，九江332000）

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤， 隨著生活水平的提高，高脂高蛋白食物的攝入，結直腸癌在中國的發(fā)病率和致死率顯著提升， 已躍居第五位，嚴重威脅著人民的生命健康[1]。

導致結直腸癌發(fā)生的原因尚不明確， 世界衛(wèi)生組織曾指出生活方式、 飲食或慢性炎癥是誘發(fā)結直腸癌的非常重要的危險因素[2]。 近年來越來越多的研究顯示細胞周期過程中癌基因的激活和抑癌基因的失活以及一連串的信號通路的改變都可能造成細胞惡性增殖、 轉化從而誘導腫瘤的發(fā)生[3]。 細胞周期素D1（CyclinD1）是重要的細胞周期的調控蛋白,調節(jié)細胞周期G1 期到S 期的轉化，完成對細胞周期進程的調控，是近年來確立的癌基因和原癌基因[4]。 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR） 屬受體酪氨酸激酶家族成員，參與激活重要的細胞信號通路，介導細胞分化、遷移、侵襲等[5]。 而腫瘤的侵襲和轉移仍然是結直腸癌患者預后差以及死亡的重要原因[6]。 血管內皮生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生成因子，是腫瘤新生血管形成及生長轉移的重要影響因素。 近年來應用于結直腸癌的靶向藥物主要包括以EGFR 信號傳導通路為靶點的藥物（帕尼單抗、西妥昔單抗）和以VEGF為靶點（貝伐單抗）的2 類藥物，研究者發(fā)現(xiàn)，靶向藥物聯(lián)合化療較單一化療可得到更好地療效[7]。 而有學者發(fā)現(xiàn)CyclinD1 可以作為晚期結直腸癌患者應用西妥昔單抗的預后指標[8]。 本研究采用免疫組織化學方法檢測結直腸癌中CyclinD1，EGFR 和VEGF 的表達，進一步探討它們與結直腸癌臨床病理特征的關系，為結直腸癌的診斷、治療及預后判斷提供參考指標， 同時為結直腸癌的分子靶向藥物的臨床應用提供數據支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料收集 2016-2019 年九江學院附屬醫(yī)院病理科存檔的接受手術治療的80 例結直腸癌患者的石蠟標本。 納入標準： ⑴無其他部位的原發(fā)腫瘤；⑵術前均未接受過放療和化療；⑶所有病例均經組織學檢查明確確診為結直腸癌；⑷臨床資料、病理資料完整。 將距離腫瘤5cm 以外的正常的腸粘膜作為對照組。 納入研究的80 例結直腸癌患者中男47 例，女33 例，年齡22-92，中位年齡60 歲；發(fā)生在左半結腸和直腸57 例，右半結腸和橫結腸23 例。 根據WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類標準，其中低級別腺癌61 例，高級別腺癌19 例（低分化腺癌9 例，黏液腺癌10 例）；累及漿膜層及漿膜外（T3-T4）68 例，不超過肌層（T1-T2）12 例；有淋巴結轉移30 例，沒有淋巴結轉移50 例。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆CyclinD1 抗體（克隆號：EP12）購自北京中杉金橋公司，鼠抗人單克隆VEGF 抗體（克隆號：MAB-0243）、 鼠抗人單克隆EGFR 抗體（克隆號：MAB-0196）、即用型快捷免疫組化MaxVision 試劑盒及DAB 顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用Max Vision 法，參照試劑說明書操作。 步驟：4μm 厚石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；EDTA 緩沖液高壓修復， 濃縮型一抗用抗體稀釋液稀釋，CyclinD1，EGFR、VEGF 的稀釋度均為1:100;4℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色，復染，脫水，封固。 用PAS 液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 CyclinD1 蛋白是定位于胞核，EGFR 蛋白主要定位于細胞膜，VEGF 蛋白主要定位于細胞漿。使用雙盲法對IHC 結果進行評分。在正置顯微鏡下， 隨機挑出5 個高倍視野來數陽性個數，IHC 染色結果評分根據前人做法[9]，根據陽性細胞數量所占百分比和染色顏色深淺進行綜合評分。評分標準為兩者相乘,再根據等級來評價結果。

評分標準為：無陽性結果為0 分，1%-19%得1分，20%-50%得2 分，51%-100%得3 分；顏色深淺強度按細胞著色深淺：染不上色得0 分，淡黃得1分，棕黃得2 分，棕褐得3 分。 兩項得分相乘，(0-4分)就是低表達，判為陰性；（6-9 分)就是高表達，判為陽性。 染色結果由兩位副主任以上職稱的病理醫(yī)師共同閱片。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析 樣本率的比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 等級相關檢驗。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結直腸癌組織中的表達結直腸癌組織中CyclinD1 的表達主要在細胞核，呈黃色至棕黃色顆粒（圖1）。 VEGF 主要定位在細胞漿（圖2）。 EGFR 主要定位在細胞膜（圖3）。 80 例結直腸癌組織中CyclinD1，VEGF 及EGFR 的陽性率分別為68.7%，66.2%，75%， 而癌旁正常組織對照組的陽性率為10%，28.7%，38.7%，CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結直腸癌組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖1 CyclinD1 在結直腸癌組織中的表達

圖2 VEGF 在結直腸癌組織中的表達

圖3 EGFR 在結直腸癌組織中的表達

2.2 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 結直腸癌中，CyclinD1 的表達與組織學分級和淋巴結轉移有關（P<0.05，表1），隨分級的增高和淋巴結轉移數量增多而增高，與性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位和浸潤深度無關（P>0.05）；VEGF 的表達與腫瘤發(fā)生部位、組織學分級和淋巴結轉移有關， 與性別、 年齡和浸潤深度無關（P<0.05，表2）；EGFR 與性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、 組織學分級、 淋巴結轉移和浸潤深度均無關（P>0.05，表3）。

表1 CyclinD1 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結直腸癌組織中表達的相關性 在CyclinD1 表達陽性的55 例結直腸癌組織當中，EGFR 及VEGF 陽性表達例數分別是44 例（80%）與37 例（67.2%）；在CyclinD1陰性表達的25 例結直腸癌組織中，EGFR 及VEGF 陽性表達例數分別是16 例（64%）與16 例（64%）； 在CyclinD1 陽性表達的結直腸癌組織當中EGFR 陽性表達率比EGFR 陰性表達的結直腸癌組織高，但不具有統(tǒng)計學意義，一定程度上可以認為CyclinD1 和EGFR、VEGF 表達之間沒有明顯的相關性。 目前關于結直腸中CyclinD1、VEGF 和EGFR 的關聯(lián)研究有限，有待進一步深入。

表2 VEGF 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

表3 EGFR 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

3 討論

結直腸癌是發(fā)生在大腸的消化道腫瘤， 發(fā)病率和病死率有逐漸升高的趨勢，高危年齡為50-60歲，男女發(fā)病比例約為2-3:1。 結直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著國人的健康。 根據第四版消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類，結直腸癌的組織病理學類型主要分為腺癌、 腺鱗癌、 梭形細胞癌、鱗狀細胞癌和未分化癌，其中，腺癌又包括了幾個亞型，如篩狀粉刺型腺癌、髓樣癌、微乳頭狀癌、 黏液腺癌、 鋸齒狀腺癌和印戒細胞癌， 超過90%的結直腸癌為腺癌。 第四版WHO 分類在分級上還提出以腺體形成比例為基礎， 傳統(tǒng)上將結直腸癌腺癌分為高、中、低分化和未分化。 臨床更多使用低度惡性及高度惡性， 因為高分化和中分化腺癌生物學相似，且重復性好[10]。 因此結合生物學行為和臨床特點我們將高分化和中分化腺癌歸為低級別腺癌， 而低分化腺癌和黏液腺癌歸為高級別腺癌。

目前， 對于結直腸癌的傳統(tǒng)治療方式包括以手術切除為主再輔以化療的綜合治療。 而對于高級別癌和某些已經發(fā)轉移的結直腸癌病人來說，預后很差，傳統(tǒng)的治療方式預后仍不容樂觀。 近年來，隨著分子靶向治療用于臨床，已經應用的治療結直腸癌的靶向藥物主要有抗血管內皮生長因子（VEGF）的藥物，如貝伐珠單抗；抗表皮生長因子受體（EGFR）的藥物，如西妥昔單抗，靶向藥物聯(lián)合傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的化療在很大程度上改善了結直腸癌患者的總生存期， 然而靶向藥物的局限性也越來越被發(fā)現(xiàn)， 例如貝伐單抗和西妥昔單抗僅僅對KRAS 野生型的轉移性結直腸癌有效，而對于這兩類靶向藥物的選擇目前沒有定論[6]。 這就說明了還要其他方面的因素影響著靶向藥物的療效[11]。

CyclinD1 是細胞周期蛋白Cyclin 家族成員之一，廣泛存在于真核細胞中，是高度保守的細胞周期家族蛋白。 CyclinD1 的編碼基因定位在11q13上，包含5 個外顯子，全長約15kb。 CyclinD1 可以和細胞周期蛋白依賴性激酶cyclin-dependent kinase（CDKs）結合，促進細胞周期從G1 到S 期的轉化[4]。 在許多腫瘤中，如食管鱗狀細胞癌，子宮內膜腺癌，乳腺癌，胸腺瘤,膀胱癌等均有過表達[12-14]。徐慧敏等[15]實驗結果顯示cyclinD1 蛋白在結直腸癌組織中的表達率為68.3%（41/60）顯著高于正常組織中，其陽性率與浸潤深度、淋巴轉移和dukes分期相關。 而我們的實驗結果表明在結直腸癌組織中CyclinD1 的表達率68.7%（55/80）高于癌旁正常組織， 與組織學分級和淋巴結轉移有關 （P<0.05）,與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度無關，結果基本是相符合的。 分化程度低且存在淋巴結轉移的腫瘤組織中陽性率較高， 提示CyclinD1 的表達促進了腫瘤的發(fā)展和轉移。

VEGF 是一種重要的促血管生成因子，可以通過血管內皮上的受體（VEGFR）介導的受體信號通路，從而調節(jié)血管內皮細胞的增殖和遷移。 VEGF在腫瘤組織中表達水平增高， 提示它促進腫瘤血管的生成，進而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 谷化平等[16]研究發(fā)現(xiàn)VEGF 表達陽性率為66.3%，高于正常腸黏膜組織，并隨著Dukes 分期增高、漿膜浸潤和淋巴結轉移， 其表達水平亦隨著顯著性增高。我們的實驗結果表明在結直腸癌組織中VEGF的表達率66.2%，高于癌旁正常黏膜組織，與腫瘤的部位，組織學分級和淋巴結轉移有關，與浸潤深度無關，這個結果跟李文婷[17]研究的結果基本一致。 近年來在結直腸癌的治療方面，很多研究關注左右半結腸癌靶向治療的差異上， 治療結果研究發(fā)現(xiàn)抗VEGF 靶向藥貝伐珠單抗高度依賴于原發(fā)瘤部位[18]，研究者在比較貝伐珠單抗和EGFR 單抗時發(fā)現(xiàn)在右半結腸癌， 一線使用貝伐珠單抗療效更優(yōu)[19]。我們的結果顯示VEGF 的表達升高與腫瘤部位有關，且右半結腸陽性率高于左半結腸，這為臨床篩選靶向藥適應的病人提供了理論依據，對于實施個體化治療有十分重要的意義。

EGFR 是酪氨酸激酶I 型受體家族成員之一，位于人體第7 號染色體的短臂， 含有28 個外顯子。 一些文獻研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織中EGFR 過度表達，與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移呈正相關[20]，但也有文獻提出了不同的觀點認為EGFR 表達和臨床病理特征之間是否具有聯(lián)系,具有何種聯(lián)系仍然存在爭議。 我們的結果顯示EGFR 表達水平與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期分級和類型無顯著相關性這與王文聞[21]的結果一致。抗EGFR 靶向藥物例如西妥昔單抗只對野生KRAS 患者有效， 明確KRAS 基因的突變狀態(tài)對結直腸癌的治療有重要意義。 但是，僅僅依靠KRAS 基因狀態(tài)并不能完美的預測抗EGFR 靶向藥物的療效,研究者推測可能存在如EGFR 信號通路BRAF、PIK3CA突變等[7]。

結直腸癌作為常見的惡性腫瘤之一， 它的治療一直備受關注，大約1/3 的腫瘤被認為是EGFR依賴型， 如何篩選出對EGFR 敏感的患者是癌癥精準治療的重要內容，zhang,W 等人發(fā)現(xiàn)CyclinD1可以作為晚期結直腸癌患者應用抗EGFR 單抗的預后指標[8]，這就提示我們CyclinD1 可能跟EGFR之間存在某種聯(lián)系， 但是很可惜本實驗利用Spearman 等級相關檢驗沒有檢測到兩個蛋白在結直腸中具有相關性聯(lián)系。 但是我們也發(fā)現(xiàn)在CyclinD1 陽性表達的結直腸癌組織當中EGFR 陽性表達率比EGFR 陰性表達的結直腸癌組織高。這也提示我們CyclinD1 可能對結直腸癌組織中EGFR 的表達起促進作用。 在今后臨床使用EGFR靶向藥時， 檢測CyclinD1 蛋白的表達可能有助于篩查對EGFR 敏感的患者。 眾所周知，免疫組化染色被廣泛用于研究， 但它始終是一種半定量的實驗方法，具有一定的不精確性，收到觀察者主觀感受的影響，因此，可能需要進一步擴大樣本或者蛋白定量實驗來探尋CyclinD1、VEGF 和EGFR 之間的關系。