清熱祛濕顆粒HPLC 特征圖譜

林忠澤張用釗黃燕玲吳盼盼盛釗君張清民?

（1.特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，廣東 臺山529200； 2.五邑大學(xué)，廣東 江門529000）

清熱祛濕顆粒由蒼術(shù)、野菊花、陳皮、黨參、茵陳、崗梅根、黃芪7 味藥材制備而成，具有清熱祛濕、益氣生津功效，用于暑濕病邪引起的四肢疲倦、食欲不振、身熱口干。清熱祛濕顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊WS3-B-1841-94）僅是簡單的對陳皮進(jìn)行薄層鑒別，而相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)也多為單味藥材、單個(gè)成分的檢測［1-3］，缺乏整體反映清熱祛濕顆粒內(nèi)在質(zhì)量的分析方法。特征圖譜是一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，能夠?qū)χ兴幹写罅炕瘜W(xué)成分信息進(jìn)行提取及量化，較為全面地反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量及某些重要的特征信息，實(shí)現(xiàn)中成藥的整體評價(jià)和對質(zhì)量有效控制［4-6］。本研究在參考相關(guān)研究［7-15］的基礎(chǔ)上，采用HPLC 法建立清熱祛濕顆粒特征圖譜，以期為其內(nèi)在質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Chromeleon 色譜數(shù)據(jù)工作站（美國戴安公司）；BP211D 型電子天平（萬分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；JP-C900 超聲波清洗器（廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司）。

綠原酸、橙皮苷、蒙花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品及崗梅對照藥材，均購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-200413、110721-201316、11528-201308、111920-201304、12115-200502。10 批清熱祛濕顆粒由特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（原廣東臺城制藥股份有限公司）提供，規(guī)格10 g／袋。

甲醇、乙腈為色譜純（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆涣姿釣榉治黾儯◤V州化學(xué)試劑廠）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 資生堂C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；檢測波長220 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照溶液

2.2.1.1 對照品 分別取綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、蒙花苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含25 μg 的溶液，即得。

2.2.1.2 對照藥材 取崗梅對照藥材1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，取出，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取清熱祛濕顆粒適量，研細(xì)，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液（批號20151001）10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄特征圖譜，以9 號峰（蒙花苷）為參照峰（S 峰），各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（批號20151001），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號201611104），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12 h 測定，各共有峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.3%，相對峰面積RSD 均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 特征圖譜建立 取10 批清熱祛濕顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，結(jié)果見圖1。通過對10 批供試品特征圖譜的分析，選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性好和特征明顯的色譜峰為共有峰，共有特征峰9 個(gè)。建立清熱祛濕顆粒特征圖譜共有模式，9 號峰峰形和峰高最好，作為參照峰，各共有特征峰相對保留時(shí)間RSD 均小于0.5%，見圖2、表2。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 清熱祛濕顆粒HPLC 特征圖譜

表2 10 批樣品共有峰相對保留時(shí)間

2.5 特征峰歸屬 精密吸取供試品溶液、崗梅對照藥材溶液、對照品溶液、空白溶液（甲醇），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，通過各峰保留時(shí)間對比分析，確認(rèn)了部分峰的歸屬，結(jié)果見圖3～5。其中，1 號峰為綠原酸，3 號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，6 號、8 號峰來源于崗梅，7 號峰為橙皮苷，9 號峰為蒙花苷。

圖3 各成分HPLC 色譜圖

圖5 特征峰歸屬分析圖

2.6 特征峰相對保留時(shí)間規(guī)定值 根據(jù)10 批清熱祛濕顆粒特征圖譜中9 個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間（以9 號峰蒙花苷為參照峰），并結(jié)合方法學(xué)考察各因子對特征峰相對保留時(shí)間的影響，制定其規(guī)定值波動(dòng)范圍在±5%以內(nèi)，分別為1.000（9 號峰）、0.202（1 號峰）、0.226（2 號峰）、0.461（3 號峰）、0.620（4 號峰）、0.639（5 號峰）、0.701（6 號峰）、0.782（7 號峰）、0.989（8 號峰）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對供試品溶液進(jìn)行190～400 nm 全波長掃描，選擇有強(qiáng)吸收者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在220 nm 處色譜峰數(shù)較多，分離度和峰形較好，最終確定其作為檢測波長。

對流動(dòng)相進(jìn)行選擇時(shí)，先考察甲醇梯度洗脫，結(jié)果基線不穩(wěn)，所以更換乙腈。再考察了乙腈-0.1%硫酸、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.05%硫酸，表明以乙腈-0.4%磷酸洗脫時(shí)特征峰信息量較豐富，故選用其作為流動(dòng)相。

本研究建立了清熱祛濕顆粒HPLC 特征圖譜，標(biāo)定了9個(gè)共有特征峰，指認(rèn)了1 號峰為綠原酸，3 號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，7 號峰為橙皮苷，9 號峰為蒙花苷，6 號、8 號峰來源于崗梅，并以蒙花苷（S 峰）作為參照峰，并規(guī)定了其他特征峰相對保留時(shí)間比值的范圍。

綜上所述，該方法簡便高效，可靠，穩(wěn)定性好，可較為全面地反映了清熱祛濕顆粒化學(xué)成分，用來評價(jià)該制劑質(zhì)量，以期彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不足，完善相關(guān)評價(jià)體系。