HPLC 法同時測定君享片中3 種成分

王 婧 顧 睿胡晗緋柏偉榮朱靖博?

（1.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港222001； 2.大連工業大學食品學院，遼寧 大連116034）

疲勞屬于中醫學“虛”“虛勞”“虛損”等范疇，根據中醫藏象學說，疲勞與五臟都有聯系，疲勞的整體功能狀態改變，有賴于五臟的共同調節。君享片經刺五加、肉蓯蓉、西洋參、丹參水提、濃縮、噴霧干燥獲得干浸膏，添加微晶纖維素混合制粒，與交聯羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂混合壓片、包衣制成的具有緩解體力疲勞功效的保健食品。該復方保健食品中標志成分為紫丁香苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷。紫丁香苷有利于能量物質的儲存和積累，加速某些導致疲勞代謝物質的清除，維持細胞的正常生理功能，延緩疲勞發生，加快疲勞恢復［1-3］。松果菊苷能拮抗自由基損傷，提高健康小鼠常壓耐缺氧和負重游泳時間，增加脾指數和胸腺指數，具有抗氧化、增強免疫力、延緩衰老、抗疲勞作用［4-5］。為了很好的控制其產品質量，需對其指標性化學成分進行含有量測定、質量控制。2015 年版《中國藥典》 中松果菊苷和毛蕊花糖苷、紫丁香苷3 種成分分別以不同的流動相及提取方法檢測，操作費時。課題組參考多篇文獻［6-13］，采用HPLC 法雙波長梯度洗脫法同時對君享片中松果菊苷、毛蕊花糖苷及紫丁香苷的含有量進行測定，以期為完善其質量標準提供參考。

1 材料

安捷倫1260 液相色譜儀，配備G1311A 四元泵、G1367B 自動進樣器、G1365D 紫外檢測器、G1322A 在線脫氣機、Agilent Chemstation 色譜工作站（美國Agilent 公司）；XS205 電子分析天平、ME303 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；5424R 離心機（奧地利Eppendorf 公司）；Mill-Q 純水機（美國Millipore 公司）；KH2200B 超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

紫丁香苷對照品（純度95.2%，批號111574-201605）、松果菊苷對照品（純度92.5%，批號111670-201706）、毛蕊花糖苷對照品（純度96.7%，批號111530-201512）均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈、異丙醇（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純（南京化學試劑公司）。君享片（0.92 g／片，60 片／瓶），由江蘇康緣藥業股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品適量，加50% 甲醇制成每1 mL 分別含紫丁香苷0.04 mg、松果菊苷0.70 mg、毛蕊花糖苷0.05 mg 的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品20 片，去包衣，研細，混勻，精密稱定粉末0.2 g，置5 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇至接近刻度，超聲處理40 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，冷卻至室溫，用50% 甲醇定容，搖勻，高速離心，取上清液，即得。

2.1.3 陰性溶液 取缺刺五加陰性制劑（無紫丁香苷）和缺肉蓯蓉陰性制劑（無松果菊苷和毛蕊花糖苷），按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-（1% 異丙醇-甲醇）（B），梯度洗脫，程序見表1；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL／min；進樣量10 μL；紫丁香苷檢測波長為265 nm，松果菊苷、毛蕊花糖苷檢測波長為330 nm。理論塔板數以紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰計達3 000 以上。樣品中色譜峰與其他峰能夠達到基線分離，保留時間合適。

表1 梯度洗脫程序

2.3 專屬性考察 精密吸取陰性溶液、對照品溶液、供試品溶液各5 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。結果表明，陰性制劑無干擾，供試品溶液中待測成分分離效果較好，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4 線性關系考察

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品適量，用50%甲醇制成混合對照品溶液（紫丁香苷0.128 mg／mL、松果菊苷2.089 mg／mL、毛蕊花糖苷0.145 mg／mL），倍比稀釋得到系列質量濃度。

2.4.2 分析結果 精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷對照品溶液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mL，紫丁香苷對照品溶液0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入50% 甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別吸取5 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣。以峰面積平均值為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程分別為紫丁香苷Y＝17 012X＋20.45（R2＝1.000 0）、松果菊苷Y＝9 151.1X＋138.45（R2＝1.000 0）、毛蕊花糖苷Y＝12 868X＋9.302（R2＝1.000 0），表明紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷分別在0.008 0～0.128 3、0.130 5～2.088 7、0.009 0～0.144 6 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣6 次，測得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為0.77%、0.31%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為0.90%、0.40%、0.30%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，測得紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷含有量RSD 分別為2.98%、2.65%、2.33%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成0.110 0、3.125、0.137 5 mg／mL 溶液。

取含有量已知的同一批君享片，去包衣，研細，精密稱定6 份，每份0.2 g（批號20170601，紫丁香苷0.610 mg／g，松果菊苷16.11 mg／g，毛蕊花糖苷0.749 mg／g），置5 mL 棕色量瓶中，加入1 mL 對照品溶液，揮干，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2”項色譜條件下進樣，計算回收率。結果，紫丁香苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷平均加樣回收率（RSD）分別為95.40%（1.10%）、103.30%（1.17%）、103.30%（1.10%），見表2。

2.9 樣品含有量測定 取3 批君享片，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下各進樣10 μL測定，外標法計算含有量，結果見表3。

3 討論

本實驗考察0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-1%異丙醇-甲醇流動相，結果表明，減少甲醇比例后毛蕊花糖苷分離度有所提升，但仍無法達到基線分離，因此更換甲醇為1%異丙醇-甲醇。此時，供試品中紫丁香苷、松果菊苷色譜、毛蕊花糖苷色譜峰均達到基線分離，保留時間合適。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

表3 各成分含有量測定結果

在供試品溶液制備時，本實驗分別對不同體積分數甲醇（30%、50%、70%）、超聲提取時間（20、30、40、50 min）進行考察，結果表明，用50%甲醇作為提取溶劑時，超聲40 min 即可提取充分。