桑葉抗氧化活性與蘆丁量效關(guān)系分析

范書生王 樂王秀環(huán)閆 昕李 曉王小萍許 嘯何 婷常艷麗折改梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488）

生物體新陳代謝或外界條件如紫外線照射等，細(xì)胞會產(chǎn)生自由基和活性氧，過多的自由基和活性氧會誘導(dǎo)癌癥、糖尿病和心腦血管疾病的發(fā)生［1-3］。攝入抗氧化劑可以清除體內(nèi)過多的自由基和活性氧，是現(xiàn)代抗氧化學(xué)說的核心觀點(diǎn)［4-8］。黃酮和多酚類化合物是天然抗氧化劑的主要來源。目前，適用于黃酮和多酚類化合物的抗氧化能力評價方法有很多［9-10］，本實驗選用了DPPH 自由基清除法與ABTS 自由基清除法、鐵離子還原能力法（FRAP），3 種方法操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高［11］。

桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒、味苦，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目功效，常用于風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花。現(xiàn)代研究表明桑葉中黃酮類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗病毒等多種活性，其作用機(jī)制與抗氧化能力密切相關(guān)［12-13］。桑葉總黃酮含有量的測定方法多采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色體系，該方法專屬性差，干擾大［14］。由于桑葉在初霜后黃酮含有量高且主要各黃酮成分（異槲皮苷和蘆丁）的含有量比例相對較穩(wěn)定［15-17］。2015 年版《中國藥典》 中桑葉的（采收期為初霜后）質(zhì)量控制是以HPLC 法測定蘆丁含有量，該方法易于操作，準(zhǔn)確度高。

課題組以蘆丁含有量為指標(biāo)，優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝。采用最優(yōu)抗氧化條件測定桑葉的抗氧化能力，建立桑葉抗氧化能力與蘆丁含有量的相關(guān)性方程，結(jié)果表明桑葉蘆丁含有量與抗氧化能力顯著相關(guān)。可將蘆丁含有量高低直接用于評價桑葉抗氧化能力強(qiáng)弱，為快速、準(zhǔn)確、科學(xué)評價桑葉抗氧化能力提供參考。

1 材料

1.1 儀器 DK-98-11 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；奧豪斯CP224C 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；SPECTROstarNano高通量紫外分光光度計（伯齊科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 桑葉共7 批，由山東宏濟(jì)堂股份有限公司范圣此博士鑒定為桑科植物桑Morus albaL.的干燥葉。蘆丁（批號J7AE-B4UQ，純度≥91%）購于中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（批號GTBXB-QP，純度≥98%）購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（批號C10165079，純度≥98%）購于上海麥克林化科技有限公司；三吡啶基三嗪（TPTZ）（批號M56418068，純度≥99%）購于上海麥克林化科技有限公司；硫酸亞鐵（批號20170412，純度≥99%）、三氯化鐵（批號20150308，純度≥99%）購于天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇（批號20171102，純度≥99.7%）、過硫酸鉀（批號20170105，純度≥99%）、無水醋酸鈉（批號20170716，純度≥99%）、冰乙酸（批號20180228，純度≥99.5%）、氫氧化鈉（批號20180126，純度≥99%）、鹽酸（批號20170621，純度≥36%）購于北京化工廠。甲醇（色譜純）；水（娃哈哈純凈水）；甲醇、乙醇均為分析純。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取桑葉約3.0 g，分別于不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40）、提取時間（30、60、90、120 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4 次）條件下提取，合并提取液，減壓回收溶劑，加80%乙醇定容至50 mL 量瓶中，即得。

2.2 桑葉蘆丁含有量測定 依據(jù)2015 年版《中國藥典》方法測定桑葉中蘆丁含有量。建立蘆丁含有量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依次進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率、精密度試驗，結(jié)果表明該方法科學(xué)準(zhǔn)確。

2.3 DPPH、ABTS、FRAP 法檢測

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 DPPH 自由基溶液 稱取DPPH 12.60 mg，置100 mL 量瓶中，加適量無水乙醇溶解并定容，搖勻，制成0.3 mmol／mL 溶液，即得。

2.3.1.2 ABTS 自由基溶液制備 稱取ABTS、K2S2O8適量，分別配制成7.4、2.6 mmol／L 貯備液，并以1∶1 比例搖勻混合，于室溫避光處保存12～16 h，實驗前用無水乙醇稀釋，使其吸光度在（0.7±0.1），即得。

2.3.1.3 FRAP 工作液制備 稱取0.455 g 無水醋酸鈉置250 mL 量瓶中，加入4 mL 冰乙酸，定容至250 mL 量瓶中，再加入1 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至3.6，制成0.3 mol／L 緩沖溶液；稱取TPTZ 0.078 g，置25 mL 量瓶中，加40 mmo／L 鹽酸溶液定容配成10 mmol／L 溶液；稱取FeCl32.78 g，置50 mL 量瓶中，加超純水定容配成20 mmol／L溶液；將上述3 種溶液以10∶1∶1 的比例混合均勻，即得（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.3.2 DPPH、ABTS 自由基溶液及FRAP 工作液UV-Vis吸收光譜 取適量供試品溶液、DPPH 自由基溶液、ABTS自由基溶液和FRAP 工作液，在200～800 nm 內(nèi)進(jìn)行UVVis 吸收光譜掃描，確定各溶液的最大吸收峰和檢測波長。

2.3.3 DPPH、ABTS 自由基溶液和FRAP 工作液穩(wěn)定試驗和測定時間 取“2.3.1.3”項下溶液各5 mL，于不同時間點(diǎn)測定吸光度。另取此3 種溶液各5 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，于不同時間點(diǎn)測定吸光度。

2.3.4 DPPH、ABTS 自由基清除能力和鐵離子還原能力試驗

2.3.4.1 DPPH 自由基清除能力 取適當(dāng)體積供試品溶液（反應(yīng)后吸光度在0.3～0.7）置于10 mL 比色管中，加入4 mL DPPH 溶液，振蕩搖勻，室溫下避光反應(yīng)120 min。以DPPH 自由基溶液作為對照，無水乙醇溶液調(diào)零，分別移取200 μL 溶液，置于96 孔板上，于516 nm 處測定吸光值，平行3 次。

2.3.4.2 ABTS 自由基清除能力 取適當(dāng)體積供試品溶液（反應(yīng)后吸光度在0.3～0.7）置于10 mL 比色管中，加入5 mL ABTS 自由基溶液，振蕩搖勻，于室溫下避光反應(yīng)25 min。以ABTS 自由基溶液作對照，無水乙醇調(diào)零，分別吸取200 μL 溶液，置于96 孔板上，于751 nm 處測定吸光值，平行3 次。

2.3.4.3 鐵離子還原能力試驗 取適當(dāng)供試品溶液（反應(yīng)后吸光值在0.3～0.7）置于10 mL 比色管中，加入5 mL FRAP 工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光反應(yīng)70 min。以雙蒸水調(diào)零，分別移取200 μL 溶液，置于96 孔板上，于594 nm 處測定吸光值，平行3 次。

3 結(jié)果

3.1 供試品溶液制備 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定單因素最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20，提取次數(shù)3次，提取時間1.5 h。運(yùn)用SAS 9.3 軟件進(jìn)行正交試驗設(shè)計，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）4 個因素分別設(shè)定3 個水平，優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

經(jīng)方差分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)對蘆丁提取率有影響（P＜0.05），影響的主次順序為B＞A＞D＞C，即料液比對提取效率影響最大，其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、提取時間。綜合各種因素，確定桑葉蘆丁最佳提取工藝為A3B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶20、提取時間90 min、提取次數(shù)3 次。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

為驗證上述提取方法，按正交方法優(yōu)化試驗，測定供試品溶液中蘆丁含有量為0.201 5%，數(shù)值最高，驗證了該方法為最佳提取工藝。

3.2 桑葉蘆丁含有量測定 依據(jù)2015 年版《中國藥典》方法測定，得蘆丁回歸方程為Y＝283.52X（R2＝0.999 7），在0.014 1～0.211 0 mg／mL 范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。該方法精密度RSD 為0.68%，穩(wěn)定性RSD 為0.96%，重復(fù)性RSD為1.38%，平均加樣回收率為102.57%，RSD 1.80%，表明該方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。按“2.1”項下最優(yōu)提取工藝制備并測得7 批桑葉含有量，見表3。

表3 各產(chǎn)地樣品蘆丁含有量測定結(jié)果

3.3 DPPH、ABTS、FRAP 試驗方法檢測

3.3.1 DPPH、ABTS 自由基溶液及FRAP 工作液UV-Vis吸收光譜 受反應(yīng)條件、使用溶劑等因素影響，不同自由基溶液的最大吸收波長各不相同，因此本實驗對DPPH、ABTS 自由基溶液、FRAP 工作液和供試品溶液的測定波長進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。DPPH 自由基溶液、ABTS 自由基溶液、FRAP 工作液，以及加入供試品溶液反應(yīng)后的3 種溶液分別在516、751、594 nm 處有吸收峰；而供試品溶液在516、751、594 nm 處均無吸收，表明該方法專屬性強(qiáng)。因此，本實驗選取516、751、594 nm 分別為DPPH、ABTS自由基溶液和FRAP 工作液的測定波長。

圖1 各樣品UV-Vis 吸收光譜圖

3.3.2 DPPH、ABTS 自由基溶液和FRAP 工作液穩(wěn)定試驗和測定時間 DPPH、ABTS 自由基溶液和FRAP 工作液易受空氣、光和氧等條件的影響，在不同時間點(diǎn)測定各溶液的吸光度，確定其溶液的穩(wěn)定性。優(yōu)化反應(yīng)時間結(jié)果顯示DPPH、ABTS 自由基溶液和FRAP 工作液分別在220、30、90 min 內(nèi)吸光值保持穩(wěn)定，見圖2，因此，溶液反應(yīng)時間須在此時間范圍內(nèi)。加入樣品液的DPPH 自由基溶液在0～100 min 內(nèi)吸光值呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，見圖2，而在100～150 min 內(nèi)吸光度基本保持不變，此時反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，120 min 可作為體系的測定時間。同樣，ABTS 自由基溶液、FRAP 工作液與供試品溶液的反應(yīng)測定時間確定為25、70 min。在衡量樣品液的鐵離子還原能力時，以1 mmol／L FeSO4溶液為對照溶液，繪制FRAP 工作液與FeSO4溶液反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以FeSO4當(dāng)量衡量抗氧化劑的鐵離子還原能力。

3.4 桑葉蘆丁含有量與抗氧化能力相關(guān)性 以加入供試品溶液體積為自變量（X），DPPH 自由基清除率均值為因變量（Y），測定了桑葉（S1～S7）的抗氧化能力，結(jié)果見表4。

以加入供試品溶液體積為自變量（X），ABTS 自由基清除率為因變量（Y），測定了桑葉（S1～S7）的抗氧化能力，結(jié)果見表5。

以DPPH、ABTS 自由基溶液擬合曲線斜率（k）為抗氧化活性指標(biāo)，計算FRAP 法FeSO4當(dāng)量結(jié)果見表6。

圖2 各溶液曲線圖

表4 各樣品線性關(guān)系（DPPH 法）

表5 各樣品線性關(guān)系（ABTS 法）

表6 各樣品抗氧化能力測定結(jié)果

DPPH 自由基可以穩(wěn)定地存在于無水乙醇中，溶液呈紫紅色，其孤對電子在516 nm 處有強(qiáng)吸收，與抗氧化劑配對使吸收值減弱；ABTS 自由基的清除是電子轉(zhuǎn)移過程，經(jīng)過過硫酸鉀氧化的ABTS 自由基溶液呈藍(lán)綠色，與抗氧化劑結(jié)合使吸光度降低；在酸性條件下，F(xiàn)e3＋-TPTZ 可被抗氧化劑還原性物質(zhì)還原為Fe2＋-TPTZ，吸光度降低。本實驗以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)反應(yīng)后的吸光度，得到相應(yīng)的FeSO4當(dāng)量，定義為FRAP 值。FRAP 值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。3 種方法都基于電子轉(zhuǎn)移的機(jī)制，適用于黃酮類和多酚類物質(zhì)抗氧化能力研究。課題組用3 種方法測定桑葉的抗氧化能力，并和桑葉蘆丁含有量兩者做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示7 批桑葉DPPH 清除自由基能力、ABTS自由基清除能力，鐵離子還原能力與蘆丁含有量相關(guān)（P＜0.01），在此基礎(chǔ)上以各批次桑葉中蘆丁含有量為自變量（X），抗氧化能力為因變量（Y）繪制擬合曲線，在DPPH、ABTS、FRAP 法下，得回歸方程分別為Y＝-0.154 8X2＋0.986 8X-0.045 8（R2＝0.948 6）、Y＝0.205 4X2-0.491 1X＋2.103 0（R2＝0.913 5）、Y＝-0.345 4X2＋4.180 1X＋0.565 6（R2＝0.914 0）。

結(jié)果表明，桑葉蘆丁含有量與桑葉抗氧化能力相關(guān)性極顯著，表明該方法在對桑葉質(zhì)量控制的同時，也可以科學(xué)、準(zhǔn)確地評價其抗氧化能力，能為其質(zhì)量控制提供參考。

4 討論

課題組發(fā)現(xiàn)，各文獻(xiàn)報道的自由基溶液配制方法較為混亂、檢測波長各不相同，反應(yīng)時間大多未做考察。在ABTS 法中，大多數(shù)文獻(xiàn)以水、無水乙醇和甲醇為稀釋液，一般選取734 nm 作為檢測波長。在實驗中課題組發(fā)現(xiàn)以無水乙醇做稀釋液時，檢測波長將紅移至751 nm，因此建議在ABTS 清除自由基的研究中，不同溶劑稀釋時，應(yīng)對應(yīng)檢測波長［18-19］。此外，本研究還對反應(yīng)時間進(jìn)行了優(yōu)化，確定了桑葉提取物與ABTS 自由基溶液反應(yīng)時間為30 min［20］。因此在評價某一中藥的抗氧化能力時，應(yīng)優(yōu)化篩選反應(yīng)時間和吸收峰的波長，以期更加準(zhǔn)確、科學(xué)地評價抗氧化劑的抗氧化能力。

結(jié)果表明，各批次、各產(chǎn)地的桑葉質(zhì)量不均一，但桑葉蘆丁含有量與其抗氧化活性密切相關(guān)，以蘆丁含有量為指標(biāo)可評價桑葉的抗氧化能力。