基于生物信息學(xué)楝酰胺A 抑制Jurkat 細(xì)胞增殖的機(jī)制

辛?xí)喳愋?敏劉苓霜?徐振曄?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海200030； 2.山東省青島市第八人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島266000）

急性T 淋巴細(xì)胞白血病是T 細(xì)胞在骨髓內(nèi)惡性增殖、抑制正常造血功能的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，骨髓中可見20%以上的原始淋巴細(xì)胞和部分幼稚細(xì)胞。急性T 淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病占兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的10%～15%，占成人急性淋巴細(xì)胞白血病的25%［1-2］，發(fā)病初期白細(xì)胞計數(shù)升高，可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤和淋巴結(jié)、肝、脾腫大，部分患者骨關(guān)節(jié)及胸骨中下段壓痛，大多數(shù)患者預(yù)后不良［3］。目前多采用化療和造血干細(xì)胞移植的方法治療急性T 淋巴細(xì)胞白血病，但患者對化療藥物敏感性不夠、耐藥性的產(chǎn)生及誘導(dǎo)緩解的失敗，以及骨髓微小殘留病灶清除緩慢，易導(dǎo)致急性T 淋巴細(xì)胞白血病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期復(fù)發(fā)，影響預(yù)后［4］。因此，迫切需要對急性T 淋巴細(xì)胞白血病患者實(shí)行有效的治療和預(yù)后監(jiān)測。楝酰胺A 是從西雙版納抗癌中藥米仔蘭中提取的環(huán)戊四氫苯并呋喃類化合物［5］。Neumann 等［6］采用楝酰胺A 干預(yù)人T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞和正常T 淋巴細(xì)胞，取細(xì)胞進(jìn)行mRNA 芯片檢測，發(fā)現(xiàn)楝酰胺A 通過激活Jurkat 細(xì)胞ATM／ATRChk1／Chk2 通路，磷酸化Cdc25 A，使Jurkat 細(xì)胞阻滯在G1／S 期，抑制細(xì)胞增殖；對正常T 細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯。本研究通過在高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫下載該芯片的數(shù)據(jù)集GSE41072 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）后 進(jìn) 行GO 分析、KEGG 通路分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）分析。通過分析DEGs 的生物功能和通路，以了解楝酰胺A 抑制Jurkat 細(xì)胞增殖過程中的分子水平機(jī)制，進(jìn)而為白血病的治療提供可能的作用靶點(diǎn)，闡明中藥提取物楝酰胺A 抗白血病的可能生物學(xué)機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)獲取 從美國國立生物技術(shù)信息中心的GEO 數(shù)據(jù)庫檢索并下載Neumann 等構(gòu)建的楝酰胺A 干預(yù)人T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞基因表達(dá)微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE41072?；蛐酒畔⑵脚_為GPL6883 Illumina HumanRef-8 v3.0 expression beadchip 人類表達(dá)譜芯片，每個陣列上有24 526 個探針。該數(shù)據(jù)集共40 個樣品，由Neumann等［6］選取人T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞和人T 淋巴細(xì)胞，采用濃度為50 nmol／L 的楝酰胺A 進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)相應(yīng)的非干預(yù)對照組，設(shè)不同時間點(diǎn)收集各組細(xì)胞，通過基因芯片對Jurkat 細(xì)胞和人T 淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析?？紤]該實(shí)驗(yàn)證明楝酰胺A 對正常T 淋巴細(xì)胞增殖抑制作用不明顯，取樣時間點(diǎn)較多，故本研究選取Jurkat 細(xì)胞的24 個樣品進(jìn)行研究，其中18 個為楝酰胺A 干預(yù)組，與對照組進(jìn)行比較。

1.2 數(shù)據(jù)處理及DEGs 篩選 將GSE41072 的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行RMA 分析和背景矯正后，進(jìn)行歸一化處理，匯總以獲取基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)［7］。采用在線基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件Morpheus（http：／ ／software.broadinstitute.org／morpheus）對楝酰胺A 干預(yù)組與對照組細(xì)胞的基因微陣列表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)分析，采用配對樣本t 檢驗(yàn)和倍比法識別DEGs，篩選同時滿足｜lgFC ｜＞1.00 和P＜0.05 的DEGs。

1.3 富集分析 將篩選得到的DEGs 輸入在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https：／ ／david.ncifcrf.gov）進(jìn)行 GO 分析和KEGG 通路分析，篩選滿足P＜0.05 的結(jié)果，得出與楝酰胺A 干預(yù)作用相關(guān)的功能富集基因和關(guān)鍵信號通路。

1.4 毒性機(jī)制相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 相互作用基因庫檢索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）數(shù)據(jù)庫包含已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用，通過對蛋白質(zhì)相互作用可能程度進(jìn)行打分，評價其可能性的大小。將與楝酰胺A 干預(yù)作用相關(guān)的DEGs 用DAIVD 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，輸入STRING 10.0 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／string-db.org），將蛋白互作結(jié)果采用Cytoscape 軟件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及MCODE 子網(wǎng)絡(luò)聚類分析，得到具有較高節(jié)點(diǎn)度（Degree）的中心蛋白。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 篩選結(jié)果 GSE41072 基因表達(dá)微陣列芯片數(shù)據(jù)集中，涉及Jurkat 細(xì)胞的樣品共24 個，其中對照組6 個，楝酰胺A 干預(yù)組18 個。DEGs 篩選結(jié)果顯示，共有122 個刺激反應(yīng)相關(guān)DEGs 被選出，其中上調(diào)基因98 個，下調(diào)基因24 個（圖1）。圖1 是基因表達(dá)水平變化最明顯得DEGs的部分表達(dá)熱圖。

圖1 DEGs 表達(dá)熱圖（部分）

2.2 GO 功能分析結(jié)果 差異表達(dá)基因GO 功能分析結(jié)果生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大部分，其中生物過程和分子功能部分結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義。生物過程部分中，P值最小的前5 個基因功能富集為細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、細(xì)胞大小相關(guān)功能，合計基因數(shù)量占61.8%；分子功能包括信號傳感器激活、端粒DNA 結(jié)合、受體結(jié)合、高分子復(fù)合物結(jié)合和肌動蛋白纖維結(jié)合。見表1、表2。

表1 GO 功能分析結(jié)果（生物過程）

表2 GO 功能分析結(jié)果（分子功能）

2.3 KEGG 通路分析結(jié)果 共有2 個通路符合P＜0.05 的閾值要求，被顯著富集。與楝酰胺A 干預(yù)Jurkat 細(xì)胞相關(guān)的信號通路，Ras 相關(guān)蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）信號通路和過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）信號通路，見表3。其中，DEGs 富集最多、最顯著的是Rap1 信號通路，說明Rap1 信號通路在楝酰胺A 抑制Jurkat 細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。楝酰胺A 干預(yù)后，DEGs 在Rap1 信號通路中的富集情況見圖2，其中五角星標(biāo)注的基因?yàn)楸磉_(dá)變化的DEGs。

表3 KEGG 通路富集結(jié)果

圖2 DEGs 在Rap1 信號通路中的富集情況

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)包括代表蛋白質(zhì)的節(jié)點(diǎn)和代表蛋白相互作用的邊，單個節(jié)點(diǎn)所連接的邊的個數(shù)稱為節(jié)點(diǎn)的度，中心蛋白是具有較高節(jié)點(diǎn)度的蛋白［8］。節(jié)點(diǎn)度最高的10 個中心蛋白編碼基因分別為表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、G 蛋白亞單位γ轉(zhuǎn)導(dǎo)素2（GNGT2）、過氧化物酶體增殖因子激活受體γ（PPARG）、核仁素（NCL）、G 蛋白亞單位 αO1（GNAO1）、大麻素受體1（CNR1）、X-射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白5（XRCC5）、G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體1（GPER1）、鞘氨醇-1-磷酸受體3（S1PR3），其中，節(jié)點(diǎn)度最高的中心蛋白編碼基因?yàn)镋GFR，說明EGFR 基因在楝酰胺A 抑制Jurkat 細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。見圖3、表4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果圖

表4 PPI 網(wǎng)絡(luò)具有較高節(jié)點(diǎn)度的前10 位中心蛋白編碼基因

3 討論

楝科米仔蘭屬植物主要分布在中國南部、印度、越南、斯里蘭卡、馬來西亞、澳大利亞等地，多為直立喬木、灌木，共130 余種。該屬許多種的根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，被當(dāng)?shù)鼐用裼糜谥委煱l(fā)熱、頭暈、咳嗽、哮喘及皮膚炎癥等［9］。米仔蘭（Agaia odorata lour.）其花味甘、辛，功效行氣解郁，主治氣郁胸悶、食滯腹脹，亦可提取芳香油作為香料；其葉味辛，性微溫，功效活血化瘀、消腫止痛，主治跌打、骨折和癰疽?！稄V西藥植名錄》 記載：“枝葉：治跌打，疽瘡”。楝酰胺A 是從米仔蘭中提取的具有抗癌活性的環(huán)戊四氫苯并呋喃類化合物［10］。Ming 等［11］最早從米仔蘭中分離出楝酰胺A，并發(fā)現(xiàn)其可以延長白血病癌細(xì)胞荷瘤小鼠的生存時間。1997 年，研究者已發(fā)現(xiàn)楝酰胺A 具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能，但機(jī)制尚未闡明［12］。之后研究者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楝酰胺A 可通過抑制MEK-ERKMnk1 信號通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞增殖和腫瘤的生長［13］。Polier 等［14］通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，楝酰胺A 的直接作用靶點(diǎn)是PHB，通過與PHB 結(jié)合，抑制PHB 與CRaf 的相互作用，從而抑制Raf-MEK-ERK 信號通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

EGFR定位于人類染色體7p12-7p13 位置，是表皮生長因子受體（HER）家族成員，該家族成員包括HER1、HER2、HER3、HER4，其中，HER1 即為EGFR（或稱為erbB1）。EGFR 編碼的蛋白質(zhì)具有酪氨酸激酶活性，是跨膜的受體型酪氨酸蛋白激酶之一，與EGF 識別并結(jié)合，通過自身磷酸化來激活下游多條信號通路，涉及細(xì)胞的增殖、遷移、分化等多個生物學(xué)過程，與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［15］。EGFR 在肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在過表達(dá)的現(xiàn)象，已成為腫瘤靶向治療的經(jīng)典靶點(diǎn)，其經(jīng)典的信號通路包括Ras-MAPK 和PI3K-Akt-mTOR 通路，兩者均與細(xì)胞增殖有關(guān)。目前，對EGFR 在血液系統(tǒng)疾病中的研究較少。劉曉亮等［16］采用黃芩提取物單體SBX 干預(yù)白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物單體SBX 通過影響EGFR、MAPK 信號通路，將細(xì)胞周期阻滯在G0 ／G1期，發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制作用。何玲等［17］通過酶聯(lián)免疫法檢測急性髓性白血病患者血清p53 和EGFR 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，患者血清中EGFR 呈高表達(dá)，說明EGFR 可能與急性髓性白血病的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。此外，臨床用于治療非小細(xì)胞肺癌的厄洛替尼（EGFR-TKI）能夠誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系中原始細(xì)胞的凋亡，與雜氮胞苷合用時阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對骨髓增生異常綜合征具有一定的治療效果［18-19］。本研究通過GO 功能分析結(jié)果表明，楝酰胺A 具有抑制人T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat 細(xì)胞增殖的作用；結(jié)合KEGG 分析和PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果，證明Rap1 信號通路及EGFR 基因在楝酰胺A 抑制Jurkat 細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用。如圖2 所示，腫瘤細(xì)胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子等，激活RTK（如EGFR、VEGFR 等），進(jìn)而激活Crk、C3G，使未活化的Rap1-GDP磷酸化生成Rap1-GTP，激活MAPK 信號通路及PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和增殖；此外，Rap1 的活化可促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、細(xì)胞黏附相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移。PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析表明，楝酰胺A 可通過下調(diào)EGFR、VEGFA 的表達(dá)，使Rap1 活化水平降低，可能影響MAPK 信號通路或PI3K-Akt 信號通路的激活，從而發(fā)揮抑制Jurkat 細(xì)胞增殖的作用。研究表明，表阿霉素誘導(dǎo)Jurkat 細(xì)胞凋亡與PI3K-Akt-mTOR 信號通路的活化有關(guān)［20］，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過對Jurkat 細(xì)胞基因表達(dá)微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE41072 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共篩選出122個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因98 個，表達(dá)下調(diào)的基因24 個。GO 基因功能分布結(jié)果顯示，DEGs 多集中于細(xì)胞增殖及其調(diào)控相關(guān)功能基因；KEGG 通路分析結(jié)果顯示，Rap1 信號通路和過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）信號通路被顯著富集，DEGs 富集最多、最顯著的是Rap1信號通路。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選出節(jié)點(diǎn)度最高的前10 個中心蛋白編碼基因是EGFR、VEGFA 等，其中EGFR 節(jié)點(diǎn)度最高。提示楝酰胺A 抗T 細(xì)胞淋巴瘤白血病的機(jī)制與Rap1 信號通路及其下游的MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等有關(guān)，EGFR 可能是其關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)。