人參皂苷Rc、Rd、Re 對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響

田 靜任雨賀劉淑瑩 萬茜淋?

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春130117； 2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春130022）

人參Panax ginsengC.A.Mey.為五加科多年生草本植物，具有補(bǔ)脾益肺、生津止渴、大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)氣生血和復(fù)脈固脫等功效，可“補(bǔ)五臟、益真氣”，是古今中外珍貴的中藥材。據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 顯示，人參葉已經(jīng)被收錄為可單獨(dú)使用的藥用品種［1］。人參中的有效成分包括皂苷、維生素、多糖、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、氨基酸、多肽及無機(jī)元素等［2-6］。其中人參皂苷具有較多的藥理作用，被認(rèn)為是人參中主要的活性成分，在人參中的含有量為4%左右［7］。已有研究表明，部分人參皂苷對(duì)乳腺癌［8］、胃癌［9］、前列腺癌［10］、肝癌［11］、肺癌［12］和結(jié)腸癌［13］等諸多種癌細(xì)胞起到顯著的抗腫瘤作用。目前，單體人參皂苷Rg3 是我國(guó)自主研制的新藥參一膠囊的主要活性成分，臨床主要應(yīng)用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，用于多種癌癥的輔助治療［14］。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，易擴(kuò)散至腦組織且單純手術(shù)治療難以將腫瘤組織徹底切除，此外膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)迅速、無邊界浸潤(rùn)和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)［15-16］。據(jù)資料顯示，人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生率占顱內(nèi)腫瘤的35%～60%，其總發(fā)病率達(dá)到5／10 萬，且發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，死亡率高居癌癥前列，惡性人腦膠質(zhì)瘤患者平均壽命僅為14 個(gè)月［17-18］。而目前單體人參皂苷類成分在對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用研究較少，本研究選取人參皂苷Rc、Rd 和Re 3 種單體皂苷，以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44 和U251MG 細(xì)胞為研究對(duì)象，探究人參皂苷Rc、Rd 和Re 對(duì)SHG-44 和U251MG 細(xì)胞的增殖影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44 和U251MG 細(xì)胞系，購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。

1.2 藥物與試劑 人參皂苷Rc 標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)B21053-20 mg）；人參皂苷Rd 標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)B21055-100 mg）；人參皂苷Re 標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)B21055-100 mg）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)11965-084）；超級(jí)新生牛血清（NBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)22011-8615）；胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)A100260-0010）；CCK-8 試劑盒（美國(guó)Med Chem Express 公司，批號(hào)HY-K0301）；青鏈霉素雙抗（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)E607011-0100）。

1.3 儀器 Ri2 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；MCO-18AC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下公司）；SC-242D 四度醫(yī)用冷藏箱（中國(guó)海爾集團(tuán)）；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；GR60DA 全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋（美國(guó)Zealway 公司）；ST8R 臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；GZX-9070MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；DK-S26 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG-44 和U251MG 細(xì)胞分別以細(xì)胞濃度為8.00×103／孔和1.00×104個(gè)／孔接種于96 孔板內(nèi)，每孔體系為100 μL；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含藥培養(yǎng)基，人參皂苷Rc 和Rd 作用于SHG-44 細(xì)胞，使藥物質(zhì)量濃度分別為0.00、1.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg／mL，人參皂苷Re 作用于SHG-44 細(xì)胞，使藥物質(zhì)量濃度為 0.00、25.00、50.00、75.00、100.00、125.00、150.00 μg／mL［18-19］；人參皂苷Rc、Rd 和Re 作用于U251MG 細(xì)胞使藥物質(zhì)量濃度為0.00、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg／mL［20-21］，每一濃度同時(shí)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以下列公式計(jì)算人參皂苷Rc、Rd 和Re 對(duì)SHG-44和U251MG 細(xì)胞的抑制率，平行3 次實(shí)驗(yàn)。抑制率＝［（OD0加藥組-OD加藥組）／（OD0加藥組-OD空白組）］×100%

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析取3 次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rc、Rd 和Re 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響 人參皂苷Rc 處理SHG-44 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL人參皂苷Rc 比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.01），見表1。人參皂苷Rd 處理SHG-44 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL 人參皂苷Rd 比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.01），見表2。人參皂苷Re 處理SHG-44 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL 人參皂苷Re 比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表1 人參皂苷Rc 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表1 人參皂苷Rc 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Rc 組比較，??P＜0.01。

表2 人參皂苷Rd 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表2 人參皂苷Rd 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Rd 組比較，??P＜0.01。

表3 人參皂苷Re 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表3 人參皂苷Re 對(duì)SHG-44 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Re 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.2 人參皂苷Rc、Rd 和Re 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響 人參皂苷Rc 處理U251MG 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL 人參皂苷Rc 比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.01），見表4。人參皂苷Rd 處理U251MG 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL 人參皂苷Rd 比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.01），見表5。人參皂苷Re 處理U251MG 細(xì)胞24、48、72 h 后，與0 μg／mL 人參皂苷Re比較，各加藥組細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.01），見表6。

表4 人參皂苷Rc 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表4 人參皂苷Rc 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Rc 組比較，??P＜0.01。

表5 人參皂苷Rd 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表5 人參皂苷Rd 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Rd 組比較，??P＜0.01。

表6 人參皂苷Re 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

表6 人參皂苷Re 對(duì)U251MG 細(xì)胞增殖抑制的影響（， n＝3）

注：同一時(shí)間，與0 μg／mL 人參皂苷Re 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

人參為中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具《神農(nóng)百草經(jīng)》記載人參性溫，味甘、微苦，具有補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄和止驚悸等藥理作用。而近年來，聯(lián)合人參皂苷單體用于輔助臨床癌癥的治療成為研究熱點(diǎn)，其中人參皂苷類成分可起到抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散、提高機(jī)體免疫力、降低放療不良反應(yīng)及延長(zhǎng)患者生存周期等功效［22-23］。人參皂苷為人參中主要有效成分，其抗腫瘤作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。據(jù)最新研究報(bào)導(dǎo)吉林大學(xué)金英花課題組進(jìn)行系統(tǒng)篩選人參皂苷人類靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了47 個(gè)靶點(diǎn)，并確認(rèn)了9 個(gè)與人類腫瘤直接相關(guān)的靶點(diǎn)，這項(xiàng)成果表明人參用于開發(fā)抗腫瘤新藥的前景廣闊［24］。

本實(shí)驗(yàn)研究采用CCK-8 法檢測(cè)人參皂苷Rc、Rd 和Re對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44 和U251MG 細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果表明人參皂苷Rc 在本實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置范圍內(nèi)，對(duì)SHG-44 腫瘤細(xì)胞的最大抑制率值為（16.74±1.02）%，對(duì)U251MG 腫瘤細(xì)胞的最大抑制率值為（20.67±0.39）%，均呈現(xiàn)較弱的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。人參皂苷Rd 具有較強(qiáng)的抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44 和U251MG 細(xì)胞增殖作用，隨著濃度的增加，抑制率逐漸升高，因此抑制作用呈濃度依賴性；其中100.00 μg／mL 的人參皂苷Rd 作用72 h 對(duì)SHG-44 腫瘤細(xì)胞抑制增殖作用最強(qiáng)；200.00 μg／mL 的人參皂苷Rd 作用24、48、72 h 均對(duì)U251MG 細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的抑制作用。而人參皂苷Re 質(zhì)量濃度200.00 μg／mL 作用72 h 的抑制率可達(dá)到（51.96±2.36）%。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)3 個(gè)單體人參皂苷，2 種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤活性的篩選，初步探討了人參皂苷Rc、Rd 和Re 對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44 和U251MG 細(xì)胞增殖抑制作用，為篩選抗SHG-44 和U251MG 細(xì)胞的單體人參皂苷及進(jìn)一步作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。