鞣花酸對糖尿病小鼠胰腺炎的改善作用

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（1.新疆醫(yī)科大學藥學院藥理教研室，新疆 烏魯木齊830011； 2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊830011； 3.烏魯木齊軍區(qū)總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830011）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為特征的慢性炎癥性疾病，胰腺的炎癥在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中扮有重要角色［1］。研究［2-4］顯示，硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）介導內質網應激，引起NOD-樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活，白細胞介素-1β（IL-1β）釋放和β 細胞凋亡。因此，胰腺TXNIP 蛋白可能是抗胰島β 細胞凋亡、保護胰腺的重要靶點。目前臨床常用治療藥物主要通過控制血糖延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，部分磺酰脲類降糖藥物長期應用甚至引起胰島素分泌耗竭，因此胰腺保護作用的天然藥物發(fā)現(xiàn)成為研究熱點。

鞣花酸（Ellagic acid，EA）是一種天然多酚二內酯，來源于葡萄、草莓、石榴等水果及堅果。研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸具有抗氧化、抗炎及抗癌等作用［5-6］，能減輕2 型糖尿病雌性大鼠肝臟氧化應激和胰島素抵抗［7］。但EA 是否能通過TXNIP／NLRP3 信號通路抑制胰腺炎癥從而發(fā)揮胰腺保護作用不清楚。本研究以高脂飼料（HFD）聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的2 型糖尿病模型小鼠為研究對象，在明確EA 具有減輕胰腺損傷作用的基礎上，探討EA 對胰腺炎癥的影響及機制，從而為EA 的臨床應用開發(fā)提供藥理學依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級純種C57BL／6 小鼠，雄性，體質量23～25 g，購于新疆醫(yī)科大學動物中心［使用許可證號SYXK（新）2016-0002］。

1.2 藥物與試劑 鞣花酸購于上海麥克林生化科技有限公司（純度≥98%，批號C10393321）；STZ 購于美國Sigma公司（批號WXBC1125）；糖化血清蛋白（GSP）試劑盒（批號A037-2-1）、IL-10 試劑盒（批號H009）、IL-1β 試劑盒（批號H002）均購自上海貝博生物科技有限公司；NLRP3（貨號WL02635）、裂解的半胱氨酸天門冬酸蛋白酶3（cleaved-caspase3）（貨號WL02117）、IL-1β（貨號WL00891）抗體、羊抗兔IgG-HRP（貨號WLA023）購自沈陽萬類生物有限公司；TXNIP（貨號K0502-3）購自北京博爾邁生物技術有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP（貨號HA1006）購自杭州華安生物技術有限公司。普通飼料購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心；高脂飼料購于南通特羅菲飼料有限公司。

1.3 儀器 YP202 N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；XS205DU 型分析天平、離心機（MULTIFUGE X3R）、酶標儀（Multiskan GO 1.01.12）、LK20180069 型制冰機（常熟市菱科電器有限公司）、血糖儀（羅氏血糖儀活力型）。

2 方法

2.1 造模、分組 C57BL／6 小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后用于實驗，隨機分為正常組、模型組、鞣花酸組，每組10 只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，6周后禁食不禁水12 h 后高脂飼養(yǎng)的動物連續(xù)2 d 腹腔注射STZ（85 mg／kg）誘導糖尿病，正常組腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 d 后剪尾取血測血糖，以空腹血糖＞11.1 mmol／L為造模成功。

2.2 給藥 高脂飼喂6 周后連續(xù)2 d 腹腔注射STZ，造模成功后進行鞣花酸干預8 周。正常組和模型組均灌胃給予蒸餾水（0.1 mL／10 g），鞣花酸組灌胃給藥，給藥劑量為50 mg ／kg，連續(xù)給藥8 周。

2.3 血糖檢測 第1、3、5、7 周末小鼠禁食不禁水6 h，稱定體質量，測空腹血糖（FBG）。

2.4 血漿生化指標檢測 鞣花酸干預8 周后，小鼠禁食不禁水 6 h，10% 水合氯醛麻醉小鼠，眼靜脈取血，3 000 r／min離心10 min 分離血漿，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明書分別檢測血漿糖化血清蛋白（GSP）、IL-1β、IL-10 水平。

2.5 胰組織蛋白表達檢測 取血結束后，處死小鼠，立即取出胰組織，提取蛋白。將各組樣品加入12% 聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80 V 恒壓電泳約125 min，待溴酚藍到達玻璃板底時，終止電泳，然后取出凝膠切下目的條帶區(qū)，轉膜至PVDF 膜上，加入5% 脫脂奶粉于37 ℃搖床下封閉2 h，加入一抗［TXNIP（1∶1 000），cleaved-caspase3（1∶400），NLRP3（1∶500），IL-1β（1∶500）β-actin（1∶1 000）］于4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗膜3 次，5 min／次，加入二抗（1∶5 000）于37 ℃孵育2 h。于Image lab軟件分析蛋白條帶圖像。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；不符合正態(tài)分布和方差齊性采用秩和檢驗。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義

3 結果

3.1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 和GSP 的影響 與正常組比較，模型組小鼠FBG、血漿GSP 水平升高（P＜0.01）；鞣花酸干預后，小鼠FBG、，血漿GSP 水平較模型組降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

表1 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組小鼠血漿中IL-1β 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠血漿中IL-1β 水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.01）。見表2。

3.3 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織凋亡蛋白表達的影響 與正常小鼠比較，模型組小鼠胰組織中cleaved-caspase 3 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰組織中cleaved-caspase3 蛋白表達減少（P＜0.01）。見圖2。

圖1 EA 對C57BL／6 糖尿病模型小鼠糖化血清蛋白（GSP）的影響

表2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

表2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP／NLRP3／IL-1β 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠胰組織中TXNIP、NLRP3、IL-1β 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰腺組織中TXNIP、IL-1β 蛋白表達減少（P＜0.01），NLRP3 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織調亡蛋白表達的影響

圖3 鞣花酸對C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP、NLRP3 和IL-1β 蛋白表達的影響

4 討論

高糖誘導TXNIP 轉錄和蛋白表達上調，進而激活NLRP3 炎癥小體，介導成熟的L-1β 的釋放，2 型糖尿病中TXNIP 蛋白的顯著上調介導的炎癥反應和氧化應激誘導胰島β 細胞凋亡［8］和胰島的功能下降［9］，使無活性的caspase3 變成裂解的caspase3。G.Leibowi 等［10］稱促凋亡因子TXNIP 為胰腺β 細胞糖毒的效應器和2 型糖尿病發(fā)生的驅動劑，下調TXNIP 不僅還能改善高血糖癥，而且還能阻止氧化應激引起的胰腺損傷［11-12］。因此，TXNIP 可能成為治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要靶點之一。

本研究結果表明，高脂聯(lián)合STZ 誘導的2 型糖尿病小鼠模型，血糖及血漿GSP 水平升高，炎癥因子水平紊亂，胰腺的促凋亡蛋白cleaved-cas3 表達顯著增加，TXNIP／NLRP3／IL-1β 信號通路激活，提示糖尿病的發(fā)生可能與TXNIP 介導的胰腺炎癥信號通路異常密切相關。EA 能降低糖尿病小鼠空腹血糖和血漿糖化血清蛋白水平，還能降低血漿促炎細胞因子IL-1β 水平，升高血漿抗炎細胞因子IL-10 水平，抑制胰腺細胞凋亡蛋白的表達，下調TXNIP 和IL-1β 蛋白表達。提示EA 對糖尿病小鼠胰腺的保護作用可能通過抑制TXNIP、IL-1β 介導的炎癥和凋亡，從而改善高糖脂及STZ 誘發(fā)的胰腺組織損傷。

綜上所述，鞣花酸可起到保護糖尿病小鼠胰腺的作用，其機制可能與抑制胰腺TXNIP／IL-1β 炎癥信號有關，本研究對富含鞣花多酚果蔬攝入的益處有新的啟示，為開發(fā)抗糖尿病胰腺損傷的天然藥物提供了新的理論基礎。