七十味珍珠丸對(duì)小鼠腸道菌群的影響

張斌斌聶 雨胡安玲徐尚福杜玉枝劉 杰?

（1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563003； 2.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810008）

藏醫(yī)藥是世界傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的重要組成成分，也是世界四大醫(yī)學(xué)之一。七十味珍珠丸是藏醫(yī)藥中最具代表性的珍寶類(lèi)藏成藥之一，在藏族地區(qū)應(yīng)用廣泛，其始載于藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》 當(dāng)中，具有調(diào)和氣血、通經(jīng)活絡(luò)等作用，主要用于治療黑白脈病、中風(fēng)、高血壓病及神經(jīng)性障礙等疾病，現(xiàn)已收載于中華人民共和國(guó)藥典2015 版中［1］。同樣在瑞士生產(chǎn)的Padma-28（與七十味珍珠丸類(lèi)似）在歐洲也受歡迎［2］。有研究認(rèn)為，七十味珍珠丸除具有保肝作用［3］外，還具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、提高學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦血管及心血管相關(guān)疾病的作用［4-5］。

佐太又稱(chēng)佐臺(tái)、佐塔，是七十味珍珠丸的基本成分之一，主要含β-HgS［6］。而汞是屬于重金屬毒物，但含汞藥物的安全性常與HgCl2來(lái)做比較，使其臨床使用大大受限［7］。而佐太（β-HgS）和HgCl2相比，其生物活性作用相差懸殊［8］。一個(gè)主要的原因是因?yàn)樽籼谀c道吸收很少［7］，那么佐太很有可能會(huì)因此改變腸道菌而發(fā)揮治療作用。

近年研究已表明腸道菌群具有很重要的生理功能［9］，大腦也可以通過(guò)腸道菌群-腸-腦軸影響腸道菌群的物種組成多樣性及其豐度變化，腸道菌群也可以通過(guò)這一通路作用于大腦進(jìn)而影響情緒、食欲、生物節(jié)律以及一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展［10-12］。七十味珍珠丸對(duì)腦相關(guān)疾病具有很好的治療效果［4，13］，但卻未見(jiàn)其對(duì)腸道菌群的影響報(bào)道。而本實(shí)驗(yàn)采用臨床劑量的藏藥七十味珍珠丸、佐太對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，在對(duì)小鼠具有保肝的有效劑量基礎(chǔ)上［14］，進(jìn)一步觀察藥物對(duì)于小鼠腸道菌群的影響變化，為藏成藥七十味珍珠丸的臨床合理使用及有效性機(jī)制研究等提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)研究其藥理作用機(jī)制也是對(duì)七十味珍珠丸評(píng)價(jià)重要的環(huán)節(jié)［15］。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK-（軍）2012-0011，體質(zhì)量（25±2）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)遵照中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例進(jìn)行，并獲遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥 七十味珍珠丸（西藏甘露藏藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z54020062），將藥丸研磨成粉，加蒸餾水配制為混懸液使用［3］；藏藥佐太由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所提供［6］；氯化汞（HgCl2，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)49H0441）；糞便基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Stool DNA Kit，天根生化科技北京有限公司，批號(hào)DP121221）；iQTMSYBR? Green SuperMix 熒光試劑盒（美國(guó)Bio-Rad 公司，批號(hào)64148508）；蛋白酶K（Proteinase K，天根生化科技北京有限公司，批號(hào)DP121221）；裂解液GSL（天根生化科技北京有限公司，批號(hào)DP121221）。

1.3 儀器 RM2245 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)和Tp1020 自動(dòng)組組脫水機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；Nanodrop 2 000 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scicentific 公司）；CFX Connect 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、藏藥佐太組（30 mg／kg）和HgCl2組（33.6 mg／kg）及七十味珍珠丸低、中、高劑量組（0.15、0.5、1.5 g／kg），每組5 只，灌胃給藥1 周，并記錄體質(zhì)量變化。末次給藥24 h 后，處死動(dòng)物取材，收集各組小鼠小腸、大腸內(nèi)容物，提取DNA。

2.2 腸道病理學(xué)觀察 取小鼠回腸一段，甲醛（4%）固定，常規(guī)組織脫水，包埋，切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，并取影像拍片。

2.3 糞便DNA 提取 采用糞便基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，將180～220 mg 糞便樣本放置裂解液GSL 中，90 ℃孵育10 min 破碎細(xì)菌，釋放DNA。用抑制劑吸附片InhibitEX 清除雜質(zhì)。上清液200 μL 移至新的離心管，加入蛋白酶K 去殘存蛋白。加入乙醇后上DNA 吸附柱，離心清洗后除雜質(zhì)后，用去酶水洗脫DNA。采用Nanodrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)菌DNA 濃度及純度（A260／280 比值在1.8～2.1 視為合格），并用去酶水配置20 ng／μL DNA 備用。

2.4 qRT-PCR 測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行，配置15 μL PCR 反應(yīng)體系。SYBR ? GREEN PCR Master Mix 7.5 μL；上、下游引物預(yù)混液1 μL；0.1% DEPC 水3.5 μL；DNA 樣品3 μL。探針序列用Primer 3 來(lái)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1，其中總菌和其它4 個(gè)菌的序列來(lái)自文獻(xiàn) ［16-17］。反應(yīng)條件，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；55～95 ℃，每0.5 ℃1 個(gè)循環(huán)，80 個(gè)循環(huán)做溶解曲線(xiàn)。取Ct 值用2-△△Ct公式計(jì)算，目的基因的表達(dá)量與同一標(biāo)本的內(nèi)參基因的表達(dá)量來(lái)校正，并與對(duì)照組為100%來(lái)計(jì)算相對(duì)的表達(dá)量。用總菌做為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 七十味珍珠丸對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 如圖1所示，給藥7 d 后，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量及藏藥佐太組小鼠體質(zhì)量無(wú)變化，HgCl2組大鼠體質(zhì)量下降（P＜0.05）。

圖1 七十味珍珠丸對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（， n＝5）Fig.1 Effects of Qishiwei Pearl Pills on body weight of mice（， n＝5）

表1 16S rRNA 引物序列Tab.1 16S rRNA sequence for PCR analysis

圖2 七十味珍珠丸對(duì)小鼠回腸組織形態(tài)的影響（HE，× 200）Fig.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on morphology of mice ileum（HE，× 200）

3.2 七十味珍珠丸對(duì)小鼠腸道病理的影響 如圖2 所示，與空白組相比，七十味珍珠丸高劑量和藏藥佐太口服給藥7 d 對(duì)小鼠腸（回腸）的組織學(xué)形態(tài)無(wú)明顯影響；而HgCl2（與藏藥佐太等汞量）口服給藥7 d，腸絨毛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.3 七十味珍珠丸對(duì)變形菌門(mén)（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的影響 如圖3 所示，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量組小鼠小腸和大腸中內(nèi)容物的變形菌門(mén)腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)（探針 Eco1457，U02514）增加（50～500 倍）（P＜0.05）；藏藥佐太組小鼠小腸內(nèi)容物中腸桿菌的表達(dá)增加（P＜0.05），而對(duì)小鼠大腸內(nèi)容物中的腸桿菌的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HgCl2組小腸內(nèi)容物中腸桿菌降低50%～70%（P＜0.05）。

3.4 七十味珍珠丸對(duì)小腸9 個(gè)腸菌科的影響 如表2 所示，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量組及藏藥佐太對(duì)小鼠小腸內(nèi)容物中的放線(xiàn)菌門(mén)（放線(xiàn)菌科、雙歧桿菌科、原小單胞菌科）、擬桿菌門(mén)-普雷沃氏菌科、厚壁菌門(mén)（厚壁菌科、乳桿菌科）的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HgCl2抑制放線(xiàn)菌門(mén)-原小單胞菌科、厚壁菌門(mén)-瘤胃球菌科／屬的表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)擬桿菌門(mén)-普雷沃氏科、厚壁菌門(mén)-乳桿菌科的表達(dá)（P＜0.05）；七十味珍珠丸低劑量組促進(jìn)擬擬桿菌門(mén)-紫單胞菌科、梭桿菌門(mén)-梭桿菌科的表達(dá)（P＜0.05），七十味珍珠丸高劑量組促進(jìn)厚壁菌門(mén)-瘤胃球菌屬科的表達(dá)（P＜0.05）。

3.5 七十味珍珠丸對(duì)大腸8 個(gè)腸菌科的影響 如表3 所示，與小腸不同，七十味珍珠丸對(duì)大腸內(nèi)容物中的放線(xiàn)菌門(mén)（放線(xiàn)菌科、雙歧桿菌科）、擬桿菌門(mén)-紫單胞菌屬、梭桿菌門(mén)-普雷沃氏菌科、梭桿菌科-梭桿菌科、厚壁菌門(mén)（瘤胃球菌科／屬、厚壁菌科、乳桿菌科）無(wú)影響；藏藥佐太組梭桿菌門(mén)-梭桿菌科下降（P＜0.05）；HgCl2組擬桿菌門(mén)-紫單胞菌屬下降（P＜0.05）。

4 討論

圖3 七十味珍珠丸對(duì)變形菌門(mén)和腸桿菌的影響（， n＝5）Fig.3 Effect of Qishiwei Pearl Pills on proteobacteria and enterobacter（， n＝5）

表2 七十味珍珠丸對(duì)小腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on small intestinal flora（%，， n＝5）

表2 七十味珍珠丸對(duì)小腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on small intestinal flora（%，， n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05。

表3 七十味珍珠丸對(duì)大腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.3 Effects of Qishiwei Pearl Pills on large intestinal flora（%，， n＝5）

表3 七十味珍珠丸對(duì)大腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.3 Effects of Qishiwei Pearl Pills on large intestinal flora（%，， n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)七十味珍珠丸顯著增加小鼠小腸和大腸內(nèi)容物中的變形菌門(mén)（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)；藏藥佐太次之，但HgCl2反下降。七十味珍珠丸和藏藥佐太對(duì)小腸內(nèi)容物菌群的影響比對(duì)大腸內(nèi)容物菌群明顯。七十味珍珠丸對(duì)小腸和大腸內(nèi)容物的梭形菌門(mén)（Fusobacteria）有所增加，對(duì)小腸內(nèi)容物的中的普雷沃氏菌（Prevotella）和梭菌（Clostridaceae）有所增加，其作用有別于藏藥佐太。HgCl2對(duì)腸菌的影響與藏藥佐太相差很大，說(shuō)明藏藥佐太（HgS）的作用不同于汞含有量相當(dāng)?shù)腍gCl2。

七十味珍珠丸是由藏醫(yī)南方學(xué)派代表人物蘇喀巴·年尼多杰于15 世紀(jì)中葉研制，18 世紀(jì)被收載于《藥方集萬(wàn)部》 中，至今已有五百余年歷史，是傳統(tǒng)藏藥大組方藥品中的典型代表，現(xiàn)在已收載于中華人民共和國(guó)藥典2015 年版［1］，搞清其藥理作用機(jī)制是對(duì)七十味珍珠丸評(píng)價(jià)重要的一環(huán)［4，17］。七十味珍珠丸主治安神、鎮(zhèn)靜、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血等，相關(guān)適應(yīng)癥有癲癇、腦出血、腦梗死、中風(fēng)等。七十味珍珠丸對(duì)于慢性脂多糖＋MPTP 引起的神經(jīng)疾病具有明顯的改善作用，能減少黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的丟失，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕脂多糖＋MPTP 引起的小鼠神經(jīng)炎癥。本課題組前期研究表明，七十味珍珠丸對(duì)脂多糖＋MPTP 引起的小鼠腸道菌群的變化也有一定的影響，能顯著防止疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）的增加，并能增加腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)。所以此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討七十味珍珠丸對(duì)正常小鼠腸道菌群的作用。本研究顯示七十味珍珠丸對(duì)正常小鼠的腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，這對(duì)探討其藥理作用打開(kāi)一個(gè)新的視野。

腸道菌群是一個(gè)龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主之間保持一定的動(dòng)態(tài)平衡，如果動(dòng)態(tài)平衡被破壞，則會(huì)導(dǎo)致或者加重相應(yīng)的疾病，如代謝性疾病［18］、肥胖、糖尿病；免疫性疾病腸道炎癥、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；腫瘤結(jié)腸直腸癌、肝癌等等［8-10］。被稱(chēng)為人體第二大腦的腸道菌群，主要是有厚壁菌門(mén)（Firmicutes，占 64%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，占23%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria，占8%）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinbacteria，占3%）的細(xì)菌所構(gòu)成［8］。本實(shí)驗(yàn)主要研究了七十味珍珠丸及藏藥佐太對(duì)小鼠腸道菌群包括厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)及梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）中部分細(xì)菌的影響。

七十味珍珠丸低、中、高劑量組及藏藥佐太組顯著升高小鼠小腸內(nèi)容物中變形菌門(mén)腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)（Eco1457 和U02514），且七十味珍珠丸高劑量組增加最多，藏藥佐太組對(duì)兩種細(xì)菌的也有增加，但HgCl2組則下調(diào)其表達(dá)。七十味珍珠丸對(duì)小鼠小腸內(nèi)容物中擬桿菌門(mén)的普雷沃氏菌屬（Prevotella）細(xì)菌的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，但隨著七十味珍珠丸劑量的增高，普雷沃氏菌的表達(dá)逐漸下降；與小腸相比，七十味珍珠丸對(duì)大腸內(nèi)容物中普雷沃氏菌細(xì)菌的表達(dá)無(wú)明顯作用，高劑量組表達(dá)下降，提示小腸菌比大腸菌更為敏感。與空白組相比，七十味珍珠丸對(duì)小腸和大腸內(nèi)容物的梭形菌門(mén)（Fusobacteria，探針KO235732）有所增加。

在健康腸道中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)均屬厭氧菌，且數(shù)量較多，腸道在消化食物時(shí)，其可產(chǎn)生有益代謝物［19］。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，七十味珍珠丸高劑量組對(duì)小鼠小腸內(nèi)容物中厚壁菌門(mén)的梭菌屬（Clostridium leptum，探針KU321269）有所增加。

在小腸中，放線(xiàn)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)分布較多，屬于腸道中的益生菌，而益生菌是對(duì)機(jī)體有益作用的微生物，也是微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分［10］。七十味珍珠丸對(duì)放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacterias，探針Act-920F3，NR 113172，KP076663）無(wú)明顯影響。

藏藥佐太是七十味珍珠丸復(fù)方中的重要組成成分（約5.8%）［20-21］，本實(shí)驗(yàn)中的藏藥佐太劑量約相當(dāng)于0.5 g／kg 的七十味珍珠丸，但其對(duì)于正常小鼠內(nèi)容物腸道菌群的影響不同于七十味珍珠丸。用約等汞量的HgCl2來(lái)比較，HgCl2對(duì)腸菌的作用不同于藏藥佐太，更不同于七十味珍珠丸。我們還發(fā)現(xiàn)藏藥佐太與不同汞化合物對(duì)小鼠的腸道病理、汞的蓄積以及腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體和腸道菌群的作用是不一樣的［22］，而汞化合物的化學(xué)形式、價(jià)態(tài)的變化是影響其毒性及生物利用的主要方式。因此不宜以HgCl2或總汞含量來(lái)對(duì)含Hg 的傳統(tǒng)藥物來(lái)進(jìn)行安全性的評(píng)價(jià)［7，23］。本研究顯示七十味珍珠丸對(duì)正常小鼠的腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，這對(duì)探討其藥理作用打開(kāi)一個(gè)新的視野。