四君子顆粒對(duì)大鼠糖尿病前期的改善作用

唐保露張 旭袁 萍朱元美楊解人鄭書(shū)國(guó)

（皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖241002）

糖尿病前期是糖代謝穩(wěn)態(tài)與糖尿病之間的過(guò)渡狀態(tài)，其血糖雖出現(xiàn)異常，但尚未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要表現(xiàn)為空腹血糖升高和糖耐量降低。雖然糖尿病前期無(wú)明顯臨床癥狀，但它是糖尿病的高危因素，許多心腦血管并發(fā)癥在此階段也已發(fā)生［1］。中國(guó)是糖尿病大國(guó)，成年人糖尿病患病率為11.6%，處于糖尿病前期的人群比率更是高達(dá)50.1%，如不及時(shí)采取積極有效的防控措施，糖尿病發(fā)病率將迅速上升，糖尿病防治形勢(shì)異常嚴(yán)峻［2］。

糖尿病前期是糖尿病發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)階段，是一種可逆狀態(tài)［3］。臨床資料顯示，控制飲食、增加運(yùn)動(dòng)等生活方式干預(yù)可明顯降低糖尿病前期發(fā)展為2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)［4］。然而，由于大多數(shù)患者對(duì)生活方式干預(yù)依從性較差，尤其是部分高危人群，亟需采取更為有效的干預(yù)措施，以延緩或阻止2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)藥在糖尿病防治方面具有豐富的理論基礎(chǔ)和臨床經(jīng)驗(yàn)，尤其是糖尿病前期，更是中醫(yī)藥發(fā)揮作用的關(guān)鍵階段。臨床實(shí)踐表明，脾虛是糖尿病前期的基本病機(jī)，益氣健脾可有效改善糖尿病前期狀態(tài)，預(yù)防糖尿病發(fā)生發(fā)展［5］。本研究依據(jù)文獻(xiàn)方法采用高糖高脂飲食誘發(fā)大鼠糖尿病前期［6］，觀察益氣健脾經(jīng)典方藥四君子湯對(duì)糖尿病前期的改善作用并探討其可能機(jī)制，以為臨床應(yīng)用益氣健脾方藥防治2 型糖尿病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2014-0001，使用許可證號(hào) SYXK（浙）2014-0008。普通大鼠飼料和高糖高脂飼料（普通飼料74%，豬油10%，蔗糖10%，蛋黃粉5%，膽固醇1%）購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心。

1.2 藥物與試劑 四君子顆粒（批號(hào)20180516）購(gòu)自李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。血糖儀及血糖試紙（批號(hào)20170303）購(gòu)自三諾生物傳感股份有限公司；血清胰島素（批號(hào)20180905）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb，批號(hào)20180906）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20181130）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；RIPA 裂解液（批號(hào)051018180717）、蛋白酶和磷酸酶抑制劑（批號(hào)051018180635）、蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)101518181113）、GRP78抗體（批號(hào)120617180313）、ATF4 抗體（批號(hào)011018180606）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；p-PERK（批號(hào)86w3361）、PERK（批號(hào)66r8853）、CHOP 抗體（批號(hào)57c6807）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司；β-actin 抗體（批號(hào)20180926）購(gòu)自博士德生物工程有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒（批號(hào)20180822）購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 儀器 Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Fluor chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 造模、給藥 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常組、模型組、四君子顆粒高、低劑量組（10.5、5.25 g／kg）。正常組喂飼普通飼料，其余各組給予高糖高脂飼料，四君子顆粒各組每天灌胃給予相應(yīng)劑量四君子顆粒，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃10 周。其間每周稱定大鼠質(zhì)量，并根據(jù)其體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 分別在給藥的第2、4、6、8、10 周末，禁食12 h，眼眶靜脈叢采血，測(cè)定空腹血糖（Fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）和糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb）水平。分離血清，ELISA 法測(cè)定空腹胰島素（fasting serum lisulin，F(xiàn)INS）水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR）＝［FBG（mmol／L）× FINS（mU／L）］／22.5。

2.3 胰島細(xì)胞凋亡檢測(cè) 第10 周末，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg／kg）麻醉，取大鼠胰腺，留取部分胰尾組織用4%多聚甲醛固定，其余胰腺組織用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，放入-80 ℃冰箱凍存，用于免疫印跡檢測(cè)。取4%多聚甲醛固定的胰腺組織，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片乙醇（5 μm），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL 染色，顯微鏡下觀察、拍照，細(xì)胞核呈棕色為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

2.4 Western blot 檢測(cè) 取胰腺組織，RIPA 裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）冰浴裂解，12 000 g、4 ℃離心15 min，收集上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后，分別放入抗GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、β-actin 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光液顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度，結(jié)果以GPR78／β-actin、ATF4／βactin、CHOP／β-actin、p-PERK／PERK 表示蛋白表達(dá)相對(duì)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS1.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 四君子顆粒對(duì)糖尿病前期大鼠FBG、GHb、FINS 和Homa-IR 的影響 如圖1 所示，喂飼高糖高脂飼料6 周后，大鼠FBG、GHb、FINS 水平和Homa-IR 升高（P＜0.05，P＜0.01），提示大鼠已進(jìn)入糖尿病前期狀態(tài)，并伴有明顯胰島素抵抗。同時(shí)給予四君子顆粒后，大鼠FBG、GHb、FINS 水平和Homa-IR 低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），提示四君子顆粒可顯著改善高糖高脂飼料誘發(fā)的大鼠糖尿病前期，減輕胰島素抵抗。

圖1 四君子顆粒對(duì)糖尿病前期大鼠FBG、GHb、FINS 水平及Homa-IR 的影響（， n＝7）Fig.1 Effects of Sijunzi Granules on levels of FBG，GHb，F(xiàn)INS and Homa-IR in prediabetic rats（， n＝7）

3.2 四君子顆粒對(duì)糖尿病前期大鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響 由圖2 所示，正常組大鼠胰島極少出現(xiàn)TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞，而喂飼高糖高脂飼料10 周后胰島染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，提示胰島細(xì)胞凋亡增加。給予四君子顆粒的大鼠胰島染色陽(yáng)性明顯減少，提示四君子顆粒可明顯減輕高糖高脂飼料誘發(fā)的大鼠胰島細(xì)胞凋亡。

圖2 四君子顆粒對(duì)糖尿病前期大鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響（×400）Fig.2 Effect of Sijunzi Granules on islet cell apoptosis in prediabetic rats（×400）

3.3 四君子顆粒對(duì)胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，喂飼高糖高脂飼料10周后，大鼠胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)升高（P＜0.01），PERK 蛋白磷酸化及其下游因子ATF4 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），提示高糖高脂飲食誘發(fā)了明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí)，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子CHOP 表達(dá)升高（P＜0.01）。給予四君子顆粒可降低GRP78 蛋白、PERK 蛋白磷酸化和ATR4、CHOP蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），提示四君子顆粒可有效抑制高糖高脂飲食誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，這可能是其減少糖尿病前期大鼠胰島細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

4 討論

糖尿病前期是2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的必經(jīng)階段，表現(xiàn)為空腹血糖升高和糖耐量降低。由于肥胖等多種因素的影響，機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，致使血糖水平升高。高血糖進(jìn)一步誘發(fā)胰島素分泌增加，出現(xiàn)以高血糖、高胰島素血癥等為特征的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病的發(fā)生發(fā)展與脾胃關(guān)系密切，“脾虛致消”“健脾愈消”理論在2 型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用［7］。本研究依據(jù)“脾虛致消”理論，采用高糖高脂飲食喂飼大鼠，以達(dá)“過(guò)食肥甘，損傷脾胃”之目的，以建立大鼠糖尿病前期模型。至6 周末，大鼠空腹血糖水平和空腹胰島素水平均明顯升高，但尚未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，胰島素抵抗指數(shù)也顯著升高，提示大鼠已進(jìn)入糖尿病前期狀態(tài)。隨著喂飼時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠糖尿病前期狀態(tài)更為明顯。給與四君子顆粒可顯著減輕高糖高脂飲食誘發(fā)的空腹血糖升高和糖耐量降低，改善胰島素抵抗，說(shuō)明四君子顆粒可明顯改善大鼠糖尿病前期狀態(tài)。

圖3 四君子顆粒對(duì)胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（， n＝4）Fig.3 Effects of Sijunzi Granules on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in pancreatic tissue（， n＝4）

在糖尿病前期階段，由于機(jī)體對(duì)胰島素敏感性下降，血糖水平明顯升高，進(jìn)一步刺激胰島β 細(xì)胞分泌胰島素，加重β 細(xì)胞負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期高負(fù)荷分泌胰島素可誘發(fā)胰島β 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［8］。GRP78 是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，生理情況下，GRP78 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)感受器IRE1、PERK 和ATF6 蛋白結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)［9］。當(dāng)胰島素合成大量增加時(shí)，超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工能力，激發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，后者可誘導(dǎo)GRP78 蛋白表達(dá)代償性增加，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性事件［10］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病前期大鼠胰腺組織GRP78 蛋白表達(dá)顯著增加，PERK 蛋白磷酸化水平明顯升高，同時(shí)其下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4 表達(dá)水平也顯著上調(diào)，提示糖尿病前期大鼠胰腺組織細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。給予四君子顆粒可顯著減少糖尿病前期大鼠胰腺組織GRP78 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)PERK 磷酸化及ATF4 蛋白表達(dá)水平，提示四君子顆粒可有效改善糖尿病前期大鼠胰腺組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，抑制PERK 信號(hào)通路的激活。

CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK、IRE1 和ATF6 信號(hào)途徑的激活均可誘導(dǎo)CHOP 表達(dá)上調(diào)，其中PERK-eIF2α-ATF4 通路是CHOP 蛋白表達(dá)的主要調(diào)節(jié)途徑［11-12］。CHOP 可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病前期大鼠胰腺組織CHOP表達(dá)顯著升高，同時(shí)胰島細(xì)胞凋亡也明顯增加，這一結(jié)果與胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4 信號(hào)通路的激活一致，提示糖尿病前期大鼠胰島細(xì)胞凋亡增加與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。給予四君子顆粒可明顯抑制PERK-ATF4 信號(hào)通路激活，下調(diào)CHOP 蛋白表達(dá)水平，減少胰島細(xì)胞凋亡，提示四君子顆粒減少胰島細(xì)胞凋亡與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)PERK-ATF4-CHOP 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，益氣健脾方藥四君子顆粒可有效改善大鼠糖尿病前期狀態(tài)，降低空腹血糖水平，提高葡萄糖耐量，其機(jī)制可能與四君子顆粒改善糖尿病前期大鼠胰島素抵抗、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡有關(guān)。