MP-SAT技術在小兒肺炎支原體肺炎中的早期診斷價值

徐雨霽 朱炳偉 劉永林

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia）又稱原發性非典型肺炎，為非典型肺炎中的一種，是由肺炎支原體（MP）感染引起，約占兒童社區獲得性肺炎（CAP）的10%～40%［1］。實時熒光定量PCR法（Quantitative real-time PCR）為目前臨床普遍采用的分子生物學診斷技術，只需要少量的DNA片段就可以檢測出，該方法檢測時間短，所需樣本量少，具有較好的靈敏度和特異性，但是還是容易出現假陽性。近年來一些新的診斷技術不斷涌現，實時熒光恒溫擴增檢測技術（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）作為新型的分子診斷技術，直接檢測存在于活菌體內的特異性RNA片段，相比于DNA檢測，具有較高的靈敏度和特異性［2］。本文對210例在本院住院治療的小兒肺炎患者咽拭子標本分別進行MP-SAT和MP-DNA檢測，并將兩者檢測結果進行分析比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年4月至2018年4月本院兒科收治的210例肺炎患兒，其中男113例，女97例；入院年齡1個月至14歲，平均年齡4歲。具體年齡分布：0～3歲90例，4～9歲105例，10～14歲15例。所有入院患兒經臨床檢查，均有發熱、咳嗽等呼吸道感染癥狀，并排除了其他病因。小兒肺炎診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》中的相關診斷標準［3-4］。所有患者均在入院當天采集咽拭子標本后立即送檢驗科檢測。

1.2 儀器與試劑 PCR儀器型號為瑞士羅氏公司生產的Cobas Z480型全自動熒光定量PCR儀。DNA檢測試劑為中山大學達安基因股份有限公司生產的MP核酸檢測試劑盒。RNA檢測試劑為上海仁度生物科技有限公司生產的MP核酸檢測試劑盒。

1.3 方法 （1）MP-DNA檢測方法：加滅菌生理鹽水1.5ml至咽拭子采樣管中，充分震蕩搖勻，吸取1ml液體至EP管中，12000rpm離心5min后去上清液，沉淀中加入50μl DNA提取液，充分震蕩混勻，100℃金屬浴10min，12000rpm再離心5min，取上清液2μl用于DNA擴增。（2）MP-SAT檢測方法：在EP管中分別加入100μl核酸提取液，10μl MP內標溶液和400μl樣本。將上述EP管放進恒溫金屬浴進行60℃溫浴，保持5min后取出，再室溫放置10min。將EP管置于磁珠分離器上，靜置5min，待磁珠吸附于管壁后，用電動吸引器吸走管中的液體，保留磁珠，并加入1ml洗滌液洗滌2遍。將EP管移離磁珠分離裝置，每管分別加入40μl擴增檢測液，取30μl 擴增檢測液（包含磁珠）至微量反應管內用于RNA擴增。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同性別和年齡組MP-SAT陽性率比較 210例肺炎患兒MP-SAT檢測發現61例陽性，總陽性率為29.0%。其中，男性患兒113例，陽性36例，陽性率為31.9%；女性患兒97例，陽性25例，陽性率為25.8%。男女患兒之間陽性率的比較，差異無統計學意義（χ2=0.94，P＞0.05）。其中0～3歲組檢測出15例陽性，陽性率為16.7%；4～9歲組檢測出41例陽性，陽性率最高為39.0%；10～14歲組檢測出5例陽性，陽性率為33.3%。其中0～3歲組與4～9歲組比較，兩組之間差異有統計學意義（χ2=11.86，P＜0.05），其余兩組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 兩種檢測方法檢測結果的比較 210份咽拭子標本分別采用MP-SAT與MP-DNA檢測，其中MP-SAT檢測出61例陽性，陽性率為29.0%；MP-DNA檢測出58例陽性，陽性率為27.6%，兩種方法間差異無統計學意義（χ2=0.11，P＞0.05）。兩種方法檢測結果相一致的患者193例，兩者之間符合率為91.9%；兩種方法檢測結果不一致的患者17例，不符合率為8.1%，其中10例樣本MP-SAT檢測陽性而MP-DNA陰性，7例樣本MP-SAT檢測陰性而MP-DNA陽性。以MPDNA法的檢出陽性率和陰性率作為對照，根據公式計算MP-SAT的相對靈敏度和特異度，結果顯示MPSAT法的靈敏度為87.9%，特異度為93.4%，見表1。

表1 MP-SAT和MP-DNA之間檢測結果的比較（n）

3 討論

本資料中MP是兒科住院患兒感染的重要病原體，男女感染機會均等，與國內其它相關報道一致［5-6］。本資料表明，不同年齡組之間MP感染陽性率差別較大，4～9歲組的陽性率最高，這可能是由于幼兒園學齡前兒童的免疫力比較弱和集體活動較多，與國內相關文獻報道基本一致［7］。其次是 10～14歲組，陽性率相比4～9歲組略有下降，可能是由于該年齡組兒童逐漸進入青春期，身體免疫功能增強。0～3歲組的陽性率最低，這可能是由于該年齡組兒童活動范圍相對較小，集體活動少有關。

本資料通過對本院210例肺炎患兒咽拭子標本分別進行MP-SAT和MP-DNA檢測發現，兩種方法的陽性率較為接近，且檢測結果具有較好的一致性和符合率（91.9%），以MP-DNA方法作為參照，與該檢測方法對比顯示MP-SAT檢測MP的相對敏感度和特異度分別為87.9%和93.4%，提示該方法具有良好的診斷價值，且特異度較高。兩種方法檢測結果有17例結果不一致，其中10例樣本MP-SAT檢測陽性而MPDNA陰性，這可能是由于：（1）標本被污染，有的污染物對DNA的擴增有抑制作用，從而造成了假陰性。（2）SAT技術的檢測靈敏度更高，在本資料中，MPDNA試劑提取采用傳統的煮沸裂解法，而MP-SAT技術的提取采用了最新的磁珠法，有相關研究報道證實，磁珠法的提取效率是煮沸裂解法的10倍，尤其在低拷貝數樣本中，明顯優于煮沸法［7］。本資料中另外有7例樣本MP-SAT檢測陰性而MP-DNA陽性，收集臨床數據進一步研究發現其中4例患兒入院前已經接受過抗生素治療，推測可能原因為MP已經被殺滅而RNA已被降解，從而造成了MP-SAT檢測結果的陰性。而另外3例樣本可能是由于操作人員的不規范操作引起的實驗室交叉污染，從而造成的假陽性結果。

綜上所述，MP-SAT技術對于兒童肺炎支原體肺炎的早期診斷具有一定價值，并具有更好的診斷敏感性和特異性，可以作為一種新的方法用于肺炎支原體的早期檢測。