Galectin-3及midkine 含量評價甲狀腺癌小鼠模型的實(shí)驗(yàn)價值研究

吳元肇 陳立

甲狀腺癌是臨床上常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)病率占全系統(tǒng)惡性腫瘤的約1%左右，根據(jù)其組織改變，可分為乳頭狀癌、髓樣癌、濾泡性癌及未分化癌，以乳頭狀癌為臨床常見類型，其預(yù)后較好，密集的乳頭狀結(jié)構(gòu)、毛玻璃樣核、核內(nèi)假包涵體及核異型重疊是其鏡下特征性表現(xiàn)，最佳的治療方法是手術(shù)治療；濾泡狀癌及未分化癌的惡性程度較高，若治療不及時，則預(yù)后不佳［1-2］。已有文獻(xiàn)報道，甲狀腺乳頭狀癌中的galectin-3陽性表達(dá)率高達(dá)90%以上，腫瘤的生長發(fā)育及惡化轉(zhuǎn)移與midkine表達(dá)有緊密的聯(lián)系，故本研究通過建立小鼠異種移植瘤模型，檢測甲狀腺癌組織中的galectin-3及midkine，目的是探討在甲狀腺癌組織中g(shù)alectin-3及midkine 的表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究選取的是健康雌性潔凈級小鼠20只，重量18～24g，由本院實(shí)驗(yàn)室動物房提供［動物合格證號：SCXK（X）2010-0003］。在實(shí)驗(yàn)開始前，對小鼠進(jìn)行為期7d的適應(yīng)性喂養(yǎng)，且無不良反應(yīng)的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。將復(fù)制成功的甲狀腺癌小鼠模型及甲狀腺腫小鼠模型應(yīng)用于本次實(shí)驗(yàn)研究中，手術(shù)前8h禁食水。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 本次實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)小鼠階段及模型復(fù)制階段全程于本院教學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)室環(huán)境良好，通風(fēng)佳，自然采光。小鼠培育期間，室內(nèi)溫度控制在21℃～25℃，濕度控制在40%～60%，12h為1個明暗周期。

1.3 腫瘤細(xì)胞株來源 甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株標(biāo)本取自臨床，保種于本院實(shí)驗(yàn)室，儲存于液氮中。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 高糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基（上海潤成生物科技有限公司），胎牛血清（FBS）（武漢普諾賽生命科技有限公司），胰蛋白酶（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），Ⅱ型膠原酶（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司），4-甲基偶氮四唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma），二甲亞砜（DMSO ）（天津市鼎盛鑫化工有限公司），β-雌二醇（上海笛柏生物科技有限公司），人促甲狀腺激素（TSH）（廣州兆康生物科技有限公司），注射用青霉素（華北制藥，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國獸藥典》），注射用硫酸鏈霉素（南岸區(qū)渝鑫獸藥經(jīng)營部，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國獸藥典》），RIPA蛋白裂解液（上海朝瑞生物科技有限公司），半乳糖凝集素-3（Galectin-3）（上海晶抗生物工程有限公司，規(guī)格：48T/96T），人中期因子（MK）（廣州邊金生物科技有限公司，規(guī)格：48T/96T），RPMI 1640培養(yǎng)基（液體）（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，規(guī)格：BS32-R7131），磷酸鹽緩沖液（PSB）（南京便診公司，規(guī)格：BZW12084）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞在含有青霉素、硫酸鏈霉素及10%FBS的RPMI 1640液體培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。1～2d換液1次，3～4d傳代。（2）小鼠移植瘤模型的建立：將20只裸鼠隨機(jī)分為2組，即空白對照組（Z組）及實(shí)驗(yàn)組（M組），每組各10只。分別選用2種細(xì)胞中生長狀態(tài)良好者重懸于無血清的液體培養(yǎng)基中，將最終的濃度設(shè)置為5×107。將配制好的2種細(xì)胞懸液分別注射至2組裸鼠的右側(cè)腋窩皮下組織，注射量為0.2ml/只。在全部注射之后，連續(xù)30d不間斷地觀察并記錄，于第31天將20只小鼠全部斷頸處死，并切取腫瘤組織以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。（3）結(jié)果判定：血清galectin-3及midkine 陽性表達(dá)的判斷依據(jù)為：由于陽性的染色信號呈棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，細(xì)胞染色的強(qiáng)度顯著性高于其底色。根據(jù)著色程度和范圍，“-”為陽性細(xì)胞數(shù)＜10%，“++”為陽性細(xì)胞數(shù)＞50%，“+”為陽性細(xì)胞數(shù)介于10%～50%。（4）組織切片的制備：將組織塊切成約0.5cm厚度，固定于包埋盒內(nèi)，用流水沖洗24h，然后將組織用酒精逐步脫水。將移植瘤標(biāo)本取出，并放入二甲苯中浸泡變?yōu)橥该鳎瑢⒅苽涑傻氖瀴K在4℃冰箱中保存以備用。標(biāo)本切片，厚度約為4μm，放置于恒溫60℃環(huán)境中烘烤6～12h。（5）免疫組織化學(xué)染色檢測galectin-3及midkine蛋白質(zhì)：以PSB代替一抗作陰性對照，使用二甲苯將組織切片進(jìn)行脫蠟，酒精泡，然后用PSB沖洗切片。分別在對應(yīng)相應(yīng)組別加入galectin-3及midkine稀釋后的抗體（稀釋度比例為1∶200），在4℃濕盒中過夜，再用PSB洗滌，滴加Ⅱ抗，再用PSB洗滌。滴加DAB顯色劑，蘇木精伊紅復(fù)染2min。常規(guī)鹽酸酒精脫水，脫水、透明、封片、鏡檢。（6）Western Blot檢測腫瘤組織galectin-3及midkine蛋白表達(dá)情況：組織總蛋白提取：取出凍存的腫瘤組織100mg，置于10ml的離心管中；加入RIPA裂解液，以4℃，1000rpm，離心后取上清液。根據(jù)Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，應(yīng)用酶標(biāo)儀確定所測蛋白樣本在A595nm的OD值，空白對照組是濃度為零孔的BSA的OD值，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算所有樣品中的蛋白濃度。Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟：首先配制分離膠，迅速混勻，然后配制濃縮膠，將蛋白樣品及Marker依次加入到濃縮膠凹槽，80V恒壓電泳進(jìn)行10min預(yù)電泳，將電壓調(diào)整到120V恒壓，當(dāng)嗅酚藍(lán)到達(dá)底部時，立即停止電泳；取出活化的PVDF膜，洗膜后置于封閉液中，并在溫度為4℃環(huán)境下過夜；稀釋一抗，比例為1∶500，在溫度為37℃恒溫箱中孵2h；TBST洗膜10min，共3次，稀釋二抗，比例為1∶5000，加入稀釋后的二抗溶液3ml，在溫度為37℃恒溫箱中孵1h；二抗結(jié)合以后，TBST洗膜l0min，共計3次，按1：1的比例混合適量ECL。滴加顯色液，凝膠成像系統(tǒng)顯色并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料服從正態(tài)分布者以（±s）表示，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。偏態(tài)數(shù)據(jù)則進(jìn)行適當(dāng)轉(zhuǎn)化。各組數(shù)據(jù)平均數(shù)之間的差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠甲狀腺組織中g(shù)alectin-3及midkine 蛋白的含量比較情況 見表1。

表1 兩組小鼠甲狀腺組織中g(shù)alectin-3及midkine蛋白的含量比較［ng/ml，（±s）］

表1 兩組小鼠甲狀腺組織中g(shù)alectin-3及midkine蛋白的含量比較［ng/ml，（±s）］

組別 例數(shù) galectin-3 midkine Z組 10 13.27±0.76 7.35±0.98 M組 10 30.82±4.63 43.71±7.21 t值 12.284 19.349 P值 0.026 0.009

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 見表2。

表2 兩組小鼠甲狀腺組織中g(shù)alectin-3及midkine蛋白的表達(dá)總陽性率比較［n（%）］

3 討論

甲狀腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率已呈逐年上升的趨勢，甲狀腺癌的發(fā)病與遺傳因素、電離輻射、雌激素水平、碘攝入量及居住環(huán)境等因素密切相關(guān)。對于甲狀腺癌的術(shù)前診斷，以彩色多普勒超聲結(jié)合細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)病理為主，結(jié)合BRAF基因檢測，有較高的確診率。

胡海霞等［3］綜述了galectin-3的研究現(xiàn)狀，關(guān)于 galectin-3的結(jié)構(gòu)特征，Barondes等［4］研究學(xué)者于1994年正式提出將之前稱之為S-lac凝集素統(tǒng)一命名為Galectin，需要符合在糖識別域有相似的顯著序列（可采用X線衍射晶體分析法證實(shí)與其相關(guān)的氨基酸殘基）和對β-半乳糖具有親和力兩條標(biāo)準(zhǔn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的galectin有15種。許文瓊等［5］學(xué)者認(rèn)為Galectin-3的過度表達(dá)使腫瘤細(xì)胞與基底膜之間的粘附增強(qiáng)，Galectin-3參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，主要通過誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化，嗜堿性細(xì)胞釋放介質(zhì)而發(fā)揮作用，Galectin-3抗細(xì)胞凋亡，這可能與bcl-2和蛋白序列同源性有關(guān)系，Galectin-3調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，可能與其參與了細(xì)胞的生長和凋亡有關(guān)，Galectin-3調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，Galectin-3具有橋梁的作用，可使相鄰細(xì)胞交聯(lián)，此外Galectin-3還具有對前 mRNA 的剪接活性。杜馥曼等［6］研究提示Galectin-3是臨床上鑒別診斷甲狀腺良性、惡性疾病的分子標(biāo)記物，在甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀腺癌等上皮來源組織中為高表達(dá)，如果在細(xì)針穿刺抽取細(xì)胞標(biāo)本的基礎(chǔ)上，將免疫組化方法與之相聯(lián)合應(yīng)用，將顯著提高臨床術(shù)前甲狀腺癌的確診率，增強(qiáng)特異性、敏感性，降低假陽性率。

Midkine又名中期因子，是視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞系胞cDNA 文庫的新表達(dá)產(chǎn)物，Midkine在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、肺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、膀胱癌等［7-8］。張曙光等［9］認(rèn)為midkine是一段富含半肽氨酸的堿性多肽，成人的midkine在血管內(nèi)皮細(xì)胞、小腸黏膜組織及部分臟器的粘液上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，在甲狀腺組織中呈中表達(dá)，在肺臟、脾臟、胃、結(jié)腸及腎臟中呈低表達(dá)，在肝臟中沒有表達(dá)。midkine可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移惡化、不良預(yù)后及耐藥性。杜麗娟等［10］認(rèn)為midkine受體包括跨膜蛋白和跨膜蛋白多糖，是一個分子復(fù)合體，目前已確定的受體包括受體型蛋白酪氨酸磷酸酶、變性淋巴瘤激酶、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白整合蛋白以及NGC等，但迄今為止仍無明確的有關(guān)midkine的完整信號通路的報道；midkine在腫瘤發(fā)生中的作用，可用于腫瘤的基因治療，midkine啟動子在腫瘤中有較高的活性，但在正常組織中的活性較低，故此可以推斷midkine啟動子具有腫瘤特異性。楊鵬飛等［11］研究表明甲狀腺惡性結(jié)節(jié)患者血清中midkine濃度水平顯著性升高，對臨床診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)有較高的應(yīng)用價值。寶榮等［12］研究結(jié)果顯示，甲狀腺良性結(jié)節(jié)組織、甲狀腺惡性結(jié)節(jié)組織中的midkine表達(dá)率分別為87%和6.7%、平均表達(dá)評分分別為1.98和0.07，甲狀腺乳頭狀癌Ⅲ、Ⅳ兩期惡性程度較高，多伴有甲狀腺腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其midkine呈強(qiáng)陽性表達(dá)，甲狀腺乳頭狀癌組織中的BRAF基因突變率為63%，而在癌旁正常甲狀腺組織中未檢測到有midkine表達(dá)及BRAF基因突變，這表明在甲狀腺乳頭狀癌組織中midkine表達(dá)增高，且表達(dá)量與甲狀腺乳頭狀癌的惡化程度及是否發(fā)生BRAF基因突變有關(guān)。王麗等［13］研究表明midkine mRNA在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且與疾病的惡化程度呈正相關(guān)關(guān)系。衛(wèi)文俊等［14］研究提示在分化型甲狀腺癌組織中midkine呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤新生微血管形成有關(guān)，在腫瘤的生長發(fā)育及轉(zhuǎn)移中均具有重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究通過建立小鼠異種移植瘤模型，觀察galectin-3及midkine 蛋白含量對診斷及鑒別診斷甲狀腺癌的臨床價值。結(jié)果顯示，galectin-3及midkine 蛋白在甲狀腺癌小鼠體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)。galectin-3及midkine可作為臨床鑒別診斷甲狀腺癌的輔助診斷指標(biāo)。