苦參凝膠大鼠陰道給藥的長期毒性研究

李瑞霞 張飛 顧性初 陳凱 蔡金娜 張杰

苦參凝膠是由苦參總堿加入賦形劑卡波姆940等輔料加工而成的陰道用中藥制劑，其主要有效成分苦參總堿，具有抑菌消炎、殺蟲、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性［1］。自2005年上市以來，苦參凝膠在臨床上廣泛用于宮頸糜爛、赤白帶下、滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等婦科慢性炎癥［2］。既往研究者通過動物急性毒性實驗［3］、皮膚過敏性實驗［4］以及陰道黏膜刺激性實驗［5］，對苦參凝膠的安全性進行了評價，但針對苦參凝膠的長期毒性尚未有研究報道。根據國家食品藥品監督管理總局（CFDA）《藥物重復給藥毒性試驗研究技術指導原則》（2014年5月），本研究對苦參凝膠可能引起的藥物長期毒性反應進行評價，為進一步規范苦參凝膠臨床安全用量提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 受試藥物均由貴陽新天藥業股份有限公司提供，苦參凝膠（國藥準字：Z20050058），批號140814；空白凝膠，批號140901。

1.2 受試動物 45只SPF級SD大鼠，雌性，體重202.9～236.2g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。大鼠飼養于可調控的房間內，晝夜各12h，溫度（25±1）℃，相對濕度40%～60%，自由飲水攝食。

1.3 實驗分組 45只雌性SD大鼠根據體重水平隨機分為3組，分別為苦參凝膠高劑量組2ml/（kg·d）、苦參凝膠低劑量組1ml/（kg·d）和對照組0ml/（kg·d）（空白凝膠），每組各15只。

1.4 給藥劑量 苦參凝膠臨床用法用量為“每晚1支，每支裝5g”，密度為1.07g/ml，即1次/d，4.67ml/次。鑒于陰道給藥能容納的最大體積，經多次預試驗，按1ml/kg系大鼠陰道可容納的最大體積，藥液不外流。苦參凝膠高劑量組動物2次/d，1ml/（kg·次），約為臨床人用等效劑量的25.6倍（成人體重以60kg計）；苦參凝膠低劑量組動物1次/d，1ml/（kg·次），約為臨床人用等效劑量的12.8倍（成人體重以60kg計）；對照組動物2次/d，1ml/（kg·次）。

1.5 大鼠長期毒性實驗 （1）一般情況觀察：三組動物連續陰道給藥13周后停止給藥，恢復期為4周，將首次給藥當天定義為試驗第1天（D1）。對所有動物每天進行1次籠邊觀察，內容包括觀察動物是否有發病、死亡、損害等情況以及食物、飲水是否充足。所有動物進行詳細的臨床體征觀察，內容包括但不限于：皮膚、毛、眼、耳、鼻、口腔、胸部、腹部、外生殖器、四肢、呼吸及循環系統、自主效應（如流涎）、神經系統（震顫、抽搐、應激反應及反常行為）；重點觀察陰道部位的分泌物狀況及其他反應，于隨機分組前進行1 次，給藥期為1次/d，恢復期為1次/周。（2）檢測指標：動物的體重在給藥前1d（D-1）和首次給藥當日（D1）各測定1次，而后的給藥期及恢復期每周測定1次并進行記錄。動物的攝食量［（24±1）h］在給藥期及恢復期測定1次/周并記錄。體溫測量和眼科檢查在給藥前5d（D-5）及給藥第46天（D46）、給藥第88天（D88）、恢復期第116天（D116）各進行1次并記錄。動物解剖分兩次進行，于給藥結束日，每組分別解剖10只大鼠；恢復期結束日，每組分別解剖剩余的5只大鼠。樣本采集前所有動物禁食過夜但不禁水。于給藥結束日（D92）及恢復期結束日（D120）當天，將各組待解剖動物用二氧化碳吸入麻醉后，經心臟穿刺采集血樣約5ml，用于血常規和血清生化學分析。對所有試驗動物進行完整的解剖檢查和詳細的外部異常情況檢查，例如可觸及的腫塊。記錄每只動物的體重和臟器重量，并計算相應的臟器系數（相對于體重和腦重量）。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進行統計學檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 SD大鼠連續陰道給予苦參凝膠13周后停止給藥，恢復期4周，在給藥期及恢復期間各組實驗大鼠外觀、行為等一般情況良好，未見動物死亡，眼科檢查亦未發現任何異常。

2.2 苦參凝膠對大鼠體重的影響 見表1。

表 1 苦參凝膠對大鼠體重的影響［g，（±s）］

表 1 苦參凝膠對大鼠體重的影響［g，（±s）］

組別 時間 低劑量組 高劑量組 對照組給藥前 D-1 218.6±5.9 218.5±5.7 218.2±6.8給藥期 D1 219.2±3.4 220.5±5.6 216.7±7.7 D8 232.0±12.3 227.9±8.3 227.5±13.9 D15 243.5±16.5 235.3±8.8 237.7±13.2 D22 255.0±17.4 244.9±9.2 250.6±16.6 D29 262.5±19.8 254.3±10.4 258.0±15.7 D36 267.9±18.4 263.7±12.7 264.6±19.2 D43 273.3±20.0 269.5±16.3 271.8±21.3 D50 282.6±20.9 273.5±15.7 277.9±21.1 D57 286.5±20.0 280.4±18.4 283.9±22.2 D64 290.0±18.6 284.7±20.9 286.6±20.9 D71 293.4±17.1 286.3±21.1 288.2±21.6 D78 295.6±17.4 287.2±21.2 290.4±23.7 D85 300.9±19.6 290.9±20.8 293.1±24.3 D92 287.1±23.2 274.4±29.7 279.3±30.3恢復期 D99 313.9±19.0 312.1±13.2 308.2±27.5 D106 308.4±15.3 316.5±11.9 311.5±22.9 D113 314.6±17.2 322.3±17.9 315.4±23.7 D120 294.4±14.4 302.2±22.4 297.0±24.8

2.3 苦參凝膠對大鼠攝食量的影響 見表2。

表2 苦參凝膠對大鼠攝食量的影響［g，（±s）］

表2 苦參凝膠對大鼠攝食量的影響［g，（±s）］

注：a：該組動物數量n=14；b：該組動物數量n=13

組別 時間 低劑量組 高劑量組 對照組給藥期 D3 16.8±3.1 17.5±5.1 18.0±2.6 D10 20.4±4.0a 20.6±3.3 20.4±4.2 D17 19.5±3.2b 21.3±4.0 20.5±3.5a D24 21.5±4.6 20.9±2.8 22.2±4.3 D31 23.8±4.2 25.5±4.8a 20.2±3.2a D38 21.2±4.7 22.9±5.6 21.2±5.5 D45 26.2±4.9 25.9±5.6 25.2±7.4 D52 25.2±8.5 25.4±5.4 23.1±5.6 D59 24.9±3.8 25.4±5.2 23.4±4.3 D66 22.8±4.0 22.6±4.4 22.5±5.9 D73 22.8±4.0 27.5±5.9 23.8±4.2b D80 16.0±4.6 15.1±4.5 18.9±5.2 D87 21.1±4.7 23.6±4.5 21.6±5.7恢復期 D94 25.5±6.3 25.5±4.1 25.7±2.7 D101 19.6±4.5 24.0±6.0 26.3±4.1 D108 22.7±4.7 26.1±7.8 25.7±7.3 D115 20.5±3.5 26.1±3.8 26.1±4.3

2.4 苦參凝膠對大鼠體溫的影響 見表3。

表3 苦參凝膠對大鼠體溫的影響［℃，（±s）］

組別 D-5 D46 D88 D116低劑量組 37.6±0.4 37.2±0.5 37.1±0.5 37.5±0.3高劑量組 37.5±0.2 38.5±0.3 36.7±0.7 38.0±0.2對照組 37.2±0.3 37.2±0.5 37.5±0.5 37.4±0.7

2.5 臨床病理學 （1）血液學指標：苦參凝膠各劑量組動物在給藥末期（D92），與對照組動物比較，高劑量組大鼠的紅細胞比積（PCV）有一定升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），但該變化為正常范圍內波動，無毒理學意義；其他血液學指標均未發現異常改變；恢復末期血液學指標也未見異常改變。（2）血清生化指標：苦參凝膠各劑量組動物在給藥末期（D92），與對照組動物比較，高劑量組大鼠的血糖（GLU）降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），但該變化為正常范圍內波動，無毒理學意義；其他指標均未發現異常改變；恢復末期血清生化學指標也未見異常改變。

2.6 解剖后評價 （1）肉眼觀察結果：苦參凝膠各劑量組在給藥末期（D92）及恢復末期（D120）與同期對照組動物解剖肉眼觀察均未發現任何異常。（2）臟器重量及系數：苦參凝膠各劑量組動物在給藥末期（D92）及恢復末期（D120），與同期對照組動物的體重、臟器重量、臟體系數及臟腦系數比較，均未見異常改變。（3）顯微鏡檢查結果：采用試驗設計劑量及給藥途徑給藥大鼠苦參凝膠13周并恢復4周，在給藥末期及恢復末期與對照組動物比較，苦參凝膠高劑量組對受試動物的陰道黏膜、陰道壁、卵巢、子宮、子宮頸、輸卵管等組織和器官均未產生明顯的毒性作用。見圖1。

3 討論

苦參凝膠屬純中藥制劑，具有清熱燥濕、殺蟲止癢的功效。其中主要的有效成分為苦參總堿，與基質卡波姆940等輔料一起加工制成棕色透明膠凍狀半固體水溶性凝膠，也是首個陰道用卡波姆凝膠劑。開發用于治療宮頸糜爛、赤白帶下、滴蟲性陰道炎及陰道霉菌感染等慢性婦科炎癥。

本研究通過連續13周陰道給予SD大鼠1ml/kg、2ml/kg的苦參凝膠，觀察苦參凝膠對大鼠的長期毒性反應及對生理生化指標的影響，結果顯示給予大鼠苦參凝膠13周未見大鼠死亡，臨床體征觀察也未見異常，且對大鼠陰道黏膜無刺激性。在給藥期和恢復期，苦生凝膠各劑量組動物體重、攝食量、體溫、血液學指標、血清生化指標、臟器重量、臟體系數及臟腦系數與同期對照組動物比較差異均無統計學意義［除給藥末期苦參凝膠高劑量大鼠紅細胞比積與血糖有差異（P＜0.05）外，為正常波動范圍，無毒理學意義］。本次試驗最大的給藥劑量為2ml/（kg·d），相當于人用臨床劑量的25.6倍，未見明顯的毒性作用。此外，許多研究［6-11］在驗證苦參凝膠治療婦科炎癥等疾病的臨床療效的同時，觀察了其不良反應的發生情況，結果均表明苦參凝膠的臨床不良反應發生率低，無明顯毒副作用。所以苦參凝膠的臨床用藥量是安全的，無明顯的毒副作用，值得在臨床推廣。