艱難梭菌分子分型與艱難梭菌感染分級的相關性研究

舒春暉 王麗倩 溫小姿 安瑞 沈浩 王賢軍

艱難梭菌（Clostridium difficile）是革蘭陽性、專性厭氧的芽孢桿菌，為人體腸道中的正常菌群，也是導致抗生素相關性腹瀉的主要原因。臨床大量使用抗菌藥物、免疫抑制劑、質子泵抑制劑或化療藥物等導致腸道微生態失衡，引發艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI），其主要致病機制與該菌產毒素A（tcdA）和毒素B（tcdB）有關［1］，毒素A是一種腸毒素，毒素B為細胞毒素，其分別由tcdA和tcdB基因編碼。據美國2014 年一項研究報道，2010年住院患者CDI的發病率比2001年幾乎增加了1倍［2］。隨著全球CDI的爆發和流行，國內感染CDI病例的報道日漸增多，MLST分型逐漸被公認為操作簡便、重復性好的分子技術。該方法通過PCR 擴增多個管家基因內部片段并測定其序列，確定細菌ST型別。2017年美國感染協會制定了關于成人和兒童艱難梭菌感染最新診療指南［3］，針對CDI癥狀的定義，腹瀉患者檢測到產毒型艱難梭菌或偽膜性結腸炎的癥狀，根據患者的白細胞數、血肌酐水平以及臨床癥狀等將CDI嚴重程度分為輕度、中度、重度和極重度的分級體系［3］。但由于我國艱難梭菌研究起步較晚，有關 CDI的系統研究報道較少，更無關于艱難梭菌毒素基因、MLST分型和CDI嚴重程度相關性的研究，作者課題組前期研究發現［4］，艱難梭菌毒素蛋白陽性患者常伴有嚴重的艱難梭菌感染，基于以上基礎，本實驗回顧性分析艱難梭菌分子分型與艱難梭菌感染分級的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3月1日至2017年5月30日杭州市第一人民醫院腹瀉患者糞便樣本860例，同時收集患者的基本臨床資料，包括患者的姓名、性別、年齡、就診科室和臨床診斷等。患者鈉入標準：腹瀉時間＞48h；腹瀉＞3次/d。采集不成形糞便標本（≥5ml）送檢，每份樣本分裝2管，-80℃凍存備用于CD培養和毒素基因檢測，已通過醫院倫理委員會的免簽知情同意書。

1.2 儀器與試劑 （1）實驗儀器：MALDI-TOF質譜儀（德國Bruker-Daltonics公司）；厭氧培養系統（荷蘭Anoxomat MARK公司）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；Veriti 96PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；裂解儀（中國博日科技有限公司）；漩渦混勻器（美國Binder公司）；高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）等。（2）實驗試劑：PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2（美國Pfizer公司）；QIAGE QIAamp DNA Stool Mini Kit（德國QIAGE公司）；艱難梭菌選擇性培養基（法國Merieux公司）。

1.3 方法 （1）艱難梭菌厭氧培養及鑒定：對860份腹瀉樣本經室溫解凍，經75%酒精處理后涂布于CCFA培養基，37℃厭氧培養48h，挑取灰黑扁片的可疑菌落采用質譜鑒定。（2）基因組DNA提取及分子檢測：艱難梭菌基因組DNA提取按照QIAGE試劑盒說明書進行。通過PCR技術擴增毒素基因A和B，其引物序列參考 Lemee［5］和 Kato［6］團隊的研究方案，tcdA的PCR反應條件如下：94℃預變性15min，35個循環94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，最后延伸72℃5min。tcdB的PCR反應條件如下：94℃預變性15min，35個循環94℃變性20s，62℃退火120s，74℃延伸40s，最后延伸72℃5min。多位點序列分型（MLST）引物參照Griffth等［7］文獻，反應體系包括PCR總反應體系50μl：滅菌雙蒸水22μl，TAKARA Taq Premix酶 25μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl。選取7個管家基因（adk，atpA，dxr，glyA，recA，sodA和tpi）進行 PCR 擴增并測序，將序列與數據庫比對，分析菌株的ST型別。（3）艱難梭菌感染嚴重分級：參照2017版美國感染病協會（IDSA）制定的艱難梭菌感染的診療指南［3］，將艱難梭菌感染嚴重程度分為3級。輕度（1級）：血白細胞升高但＜15000/mm3，且血肌酐＜1.5mg/dl；中度（2級）：血白細胞＞15000/mm3，或血肌酐＞1.5mg/dl；重度和極重度（3級）：出現由艱難梭菌感染引起的低血壓、休克、腸梗阻、巨結腸等嚴重疾病。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗和Fisher確切概率法的數據分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料 根據患者的臨床資料和檢測結果，860例腹瀉糞便中共檢出艱難梭菌98例，產毒型艱難梭菌94株，tcdA-tcdB+菌株52株（55.3%，52/94），tcdA+tcdB+菌株42株（44.7%，42/94）。其中男52例，女42例。社區CDI構成比占45.7%，院內CDI構成比占54.3%。

2.2 不同艱難梭菌毒素基因表型和CDI患者臨床指標結果分析 統計分析毒素基因tcdA-tcdB+與tcdA+tcdB+在腹瀉次數、血白細胞計數、肌酐水平及白蛋白數值的差異，血白細胞計數和肌酐水平的差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同艱難梭菌毒素基因表型的CDI患者臨床指標結果分析（±s）

表1 不同艱難梭菌毒素基因表型的CDI患者臨床指標結果分析（±s）

項目 tcdA-tcdB+（n=52） tcdA+tcdB+（n=42） t值 P值腹瀉次數（次/d） 3.9423±1.56448 3.5476±1.25333 -1.049 0.294白細胞計數（×109/L） 11.4327±5.38767 8.5721±3.01014 -2.434 0.015白蛋白（g/L） 35.3923±9.07174 37.2643±8.40267 -0.776 0.438肌酐（μmol/L） 90.6731±92.54818 59.3817±21.13482 -2.211 0.027

2.3 艱難梭菌毒素基因表型與CDI類別的相關性分析 艱難梭菌毒素基因tcdA-tcdB+患者在院內CDI占61.5%，毒素基因tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+在院內和社區CDI的構成比無明顯差異（P=0.115）。艱難梭菌毒素基因tcdA-tcdB+患者中21.2%為CDI Ⅲ級，毒素基因tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+的CDI各級構成比有差異（P=0.007），表明tcdA-tcdB+相比tcdA+tcdB+更易引起嚴重的艱難梭菌感染。見表2。

表2 艱難梭菌毒素基因表型與CDI類別的相關性分析［n（%）］

2.4 艱難梭菌MLST分型中ST37型與非ST37型患者各臨床檢測結果分析 94株艱難梭菌共分離出15種ST型，其中數量最多的分別為ST37型25株（26.6%，25/94），ST54型20株（21.3%，20/94）和ST81型15株（16.0%，15/94）。分析ST37型與非ST37型在腹瀉次數、血白細胞計數、肌酐水平及白蛋白數值的差異，發現腹瀉次數和血白細胞計數差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 艱難梭菌ST37型和非ST37型中CDI患者臨床指標結果（±s）

表3 艱難梭菌ST37型和非ST37型中CDI患者臨床指標結果（±s）

類別 ST37（n=25） 非ST37（n=69） t值 P值腹瀉次數（次/d） 5.357±1.906 5.025±6.647 -2.862 0.004白細胞計數（×109/L） 12.316±5.309 9.395±4.239 -2.453 0.014白蛋白（g/L） 37.212±8.431 35.827±8.998 -0.702 0.483肌酐（μmol/L） 91.840±97.266 71.588±60.139 -1.023 0.306

2.5 艱難梭菌ST37型和非ST37型與CDI類別的相關性分析 艱難梭菌ST37型與非ST37型在院內和社區CDI的構成比無明顯差異（P=0.792）。但艱難梭菌ST37型和非ST37型患者CDI各級構成比有顯著差異（P=0.011），其中ST37型患者中28.0%為CDI Ⅲ級，表明艱難梭菌ST37更易引起嚴重的CDI，見表5。

表5 艱難梭菌ST37型和非ST37型與CDI類別的相關性分析

3 討論

2000年以來，艱難梭菌相關性感染的發病率不斷上升，尤其是高毒力菌株RT027/NAP1/BI在歐美地區暴發流行，病死率也迅速增加，已成為影響全球公共衛生的健康問題［8］。我國 CD感染率也正在不斷上升，Chen等［9］研究了浙江省三甲醫院的1845位腹瀉患者，并分離到艱難梭菌產毒菌株161株，分離率8.73%，本次研究中產毒素株分離率高達10.9%（94/860），足見我省艱難梭菌感染的嚴重性。毒素是艱難梭菌感染主要的致病因素，毒素A是腸毒素，主要引起腸道炎癥，導致腸壁出血壞死；毒素B是細胞毒素，可刺激單核細胞釋放炎性細胞因子，直接損傷腸壁細胞，嚴重的甚至造成偽膜性腸炎［10］。歐美國家流行的艱難梭菌主要以tcdA+tcdB+菌株為主，而亞洲國家tcdA-tcdB+菌株主要以ST37為主［11］，本研究顯示，tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+基因表型為主要流行特征，其中tcdA-tcdB+ 基因型的大部分菌株是ST37型，這和Dazhi Jin等［12］關于艱難梭菌在中國東部的分子流行病學研究的報道一致。

本研究發現tcdA-tcdB+菌株比tcdA+tcdB+菌株更能引起CD感染患者白細胞計數和肌酐水平升高，并且CDI Ⅲ級中全為tcdA-tcdB+基因型，提示tcdA-tcdB+可能更易引起嚴重CDI。有報道顯示，只產毒素B的菌株（tcdA-tcdB+）容易引起暴發流行和偽膜性結腸炎［13］。也有 Pengcheng Du等［14］提出，tcdA-tcdB+毒素表型的艱難梭菌容易引起醫院感染爆發，并在全球范圍內被頻繁檢出，tcdA-tcdB+患者常伴有嚴重的臨床癥狀和較高復發率，但其發病機制尚待進一步研究。

ST37型是目前中國常見的流行特征［15］，本研究發現CDI Ⅲ級的11例患者中7例為ST37型。由Tian等提出［16］，ST37型有更強的致病能力和耐藥性。國內少有文獻關于ST37型與臨床檢驗結果相關性的報道，本研究發現ST37型比非ST37型腹瀉次數更多、白細胞計數更高，且差異有統計學意義，這可能是因為ST37型的tcdA和tcdB基因與高毒力菌株具有相似性，表現出更強的毒性［17］，導致患者臨床癥狀更明顯，病情更嚴重。但ST37型的致病機制仍不清楚。

綜上所述，毒素基因tcdA-tcdB+比tcdA-tcdB+患者白細胞計數和肌酐水平更高，常伴有嚴重的腹瀉等癥狀。ST37型患者腹瀉次數更多、白細胞計數更高，更容易導致艱難梭菌感染。因此，對艱難梭菌感染患者應及時進行菌株毒素基因檢測和MLST分型，可為臨床更精準的診療提供幫助。