結腸腺癌中Dyrk1B的表達及對臨床預后判斷的價值

蔣淳琪 張磊

結腸腺癌是由結腸黏膜上皮異型增生形成的腫瘤，臨床較為常見，主要發生于中老年人，與病變相關分子生物學機制較多，其涉及遺傳學和增殖基因調控的領域［1］。雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶1B（dual specificity tyrosinephosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B）是一種絲氨酸或酪氨酸蛋白激酶，位于19號染色體上，在腦組織或肌肉組織中表達，其它正常組織中表達較少［2］，近年研究顯示Dyrk1B在幼稚的細胞中表達升高，其可能與腫瘤的形成有關［3］。Dyrk1B在結腸腺癌中的表達未見相關報告，對預后的判斷價值尚無研究。本實驗應用免疫組化、Western Blot和熒光實時定量PCR法檢測結腸腺癌中Dyrk1B的表達，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般材料 選擇2012年1月至2014年12月在寧波市中醫院確診為結腸腺癌，并行手術治療的患者作為研究對象。共觀察87例，其中男47例，女40例；年齡40～87歲，平均62.3歲，中位年齡59歲。均留取腫瘤組織的新鮮組織和石蠟包埋組織作為觀察組，留取距腫物邊緣＞3cm的正常結腸黏膜的新鮮組織和石蠟包埋組織作為對照組。新鮮組織應用-80℃冰箱凍存備用。本研究由醫院倫理委員會批準，并經家屬簽訂知情同意書。納入標準：（1）由病理醫師復診切片，并按WHO的標準分型者。（2）原發腫瘤者。排除標準：（1）手術前接受放、化療者。（2）林奇綜合征者；（3）消化系統發育畸形者；（4）伴有其它器官惡性腫瘤者。

1.2 Dyrk1B表達的檢測及結果判定 （1）免疫組化法：術后標本常規取材，應用福爾馬林固定，脫水機脫水，并行石蠟包埋，切4μm切片后置于膠片上，應用免疫組化二步法檢測Dyrk1B的表達。Dyrk1B濃縮液購自ABGENT公司，二抗和DAB購自福州邁新公司。先進行預實驗，選擇1：200顯色最理想的濃度用于正式實驗。操作由同一檢驗師操作完成，做好質控工作，減少人為誤差。Dyrk1B的顯色部位是細胞漿，以棕黃色為陽性細胞。由兩位病理醫師應用盲法進行判讀，選擇上皮細胞分布集中的熱點區進行觀察，共選擇5個400倍視野，以陽性率＜10%為陰性，以＞10%為陽性計算陽性率。（2）Western Blot法檢測：取新鮮凍存標本，適當的裂解液處理組織樣品，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻至室溫后，將蛋白樣品直接上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內。轉膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1～2min，以洗掉膜上的轉膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60min。對于一些背景較高的抗體，4℃封閉過夜。吸盡封閉液，加入稀釋好的一抗，室溫搖床上孵育1h或者4℃孵育過夜。吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或者4℃搖床上孵育1h。ECL化學發光，顯影，定影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目的條帶和內參條帶的凈光密度值以及他們的比值。應用新鮮凍存組織。內參應用GAPDH。取新鮮組織，提取總蛋白，測定試劑盒定量，丙烯酰胺凝膠電泳，經濕轉法轉至PVDF膜，牛奶封閉后稀釋好抗體，4℃置于冰箱中過夜，取出后進行洗滌，加入二抗，孵育2h，化學發光劑顯影，并拍照，用凝膠分析軟件對圖像進行分析。灰度分析應用Image J V1.47H軟件，以蛋白與GAPDH的比值進行分析其相對表達量。（3）熒光PCR法檢測：檢測新鮮標本中Dyrk1B的mRNA的表達。記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算目的基因和相對表達水平。ΔΔCt=［Ct目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）］。操作嚴格按實驗步驟完成，均由同一實驗師完成，做好質控工作。

1.3 統計學方法 采用SAS6.12分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 （1）兩組中Dyrk1B陽性率的比較：觀察組中Dyrk1B的陽性率均明顯高于對照組（見表1）。（2）觀察組不同特征分組中Dyrk1B陽性率比較：觀察組中Dyrk1B的表達與腫瘤最大徑、淋巴結轉移、增殖指數、脈管累犯、神經累犯和TNM分期密切相關，Dyrk1B的表達與性別、年齡、部位、分化程度和炎細胞浸潤程度無明顯相關性（見表2）。（3）觀察組中Dyrk1B表達的生存分析：術后隨訪患者時間為6～60個月，應用生存分析顯示觀察組中Dyrk1B與生存時間有關，即Dyrk1B高表達患者的生存時間短，預后差（見圖1）。

表1 兩組中Dyrk1B陽性率的比較［n（%）］

表2 觀察組不同特征分組中Dyrk1B陽性率比較［n（%）］

圖1 結腸腺癌中Dyrk1B與生存時間的關系

2.2 兩組中Western Blot法檢測Dyrk1B蛋白半定量表達的比較 觀察組中Dyrk1B的半定量表達量為（0.98±0.20），對照組中Dyrk1B的半定量表達量為（0.68±0.21），兩組比較差異有統計學意義（P=0.010）。（見圖2）。

2.3 兩組熒光實時定量PCR法檢測Dyrk1B mRNA的比較 觀察組中Dyrk1B mRNA表達的陽性率為（1.12±0.24）%，對照組中Dyrk1B mRNA表達的陽性率為（0.80±0.26）%，兩組比較差異有統計學意義（P=0.021）。

圖2 Western Blot法檢測觀察組和對照組中Dyrk1B的表達

3 討論

結腸癌的形成與細胞的異型增殖有關，Dyrk1B又稱為Mirk，其基因位于19號染色體q12-13.11上，由11個外顯子和10個內含子組成，其具有三種剪接變形體，即P65、P69和P75。由于P65在體外缺乏激酶活性并不含有酪氨酸磷酸化功能，因此其激酶的不同功能與剪接差異有關［4］。有研究將Dyrk1B基因敲除后發現可以改變調控腫瘤細胞增殖分化的相關蛋白，如PRAP、bcl-2等，進而抑制腫瘤細胞增殖和分化［5］。Dyrk1B敲除后不引起胚胎致死，有觀點認為Dyrk1B與正常細胞的形成無必然聯系，Dyrk1B可能是腫瘤治療的靶點［6］。缺氧和低pH值等因素能誘導腫瘤細胞異常表達Dyrk1B，使細胞進入暫時性休眠狀態的G0期，并在E2F4復合物的作用下穩定停留在 G0期，該階段可促進腫瘤細胞完成ROS損傷的修復過程，并減少毒性ROS自由基的產生［7］。血清“饑餓”誘導結腸癌細胞進入G0期，腫瘤細胞內的Dyrk1B敲除后逃離G0期的腫瘤細胞迅速增加［8］。Dyrk1B通過磷酸化阻止細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制子P27的降解使細胞處于G0期。Dyrk1B無論擴增與否，均可通過磷酸化降低cyclinD1與cyclinD3的穩定性，使細胞處于高度活躍狀態。Dyrk1B對組織發育和染色質重塑的作用更明顯，Dyrk1B的作用方式可能更多［9］。Dyrk1B可能下調Spry2和ERK MAPK途徑發揮促進腫瘤增殖、遷移的作用［10］。ERK下調后可以激活MMPs的調節，能促進細胞外基質的降解，加速腫瘤細胞的遷移。Dyrk1B在腫瘤遷移過程中可能對上皮間質轉化有一定的促進作用［11］。

本實驗結果顯示，結直腸腺癌中Dyrk1B的表達明顯高于對照組，提示Dyrk1B是腫瘤形成的促進蛋白，其作用與促進腫瘤細胞增殖有關，Dyrk1B通過P27調控CyclinD1的結合，進而調控細胞G0靜止期通過檢測控制進入S期。Dyrk1B的腫瘤細胞特異性，可作為腫瘤細胞治療靶點開發抗癌藥物，同時，其下游調控的細胞周期蛋白Cdk4抑制劑已成為抗癌藥物，二者協同作用可增強腫瘤治療特性。觀察組中Dyrk1B的表達與腫瘤最大徑和增殖指數相關，提示Dyrk1B高表達是促進腫瘤細胞失控性增殖的重要蛋白因素，Dyrk1B對細胞的增殖作用使細胞的增生活躍，細胞的數量增多，異型細胞增加，腫瘤體積增大，細胞侵襲生長的能力增強。結果顯示Dyrk1B的表達與淋巴結轉移、脈管累犯和神經累犯相關，提示Dyrk1B直接參與腫瘤的進展及腫瘤細胞的播散。Dyrk1B高表達引起細胞的遷移作用也提示可能是轉移相關基因的作用。Dyrk1B可以引起細胞增生，增生的細胞幼稚，體積小，遷移能力強，是轉移的重要腫瘤細胞，且細胞遷移后，幼稚的細胞適應異源性組織的能力強，定植程度高，腫瘤細胞在非原發灶的部位生長繁殖。結果顯示Dyrk1B的表達與TNM分期相關，提示可能是判斷腫瘤分期的輔助指標。本研究未發現Dyrk1B的表達與分化程度和炎細胞浸潤程度的相關性，提示Dyrk1B與幼稚細胞的異型增生和炎性周圍環境無明顯關聯性。結果顯示Dyrk1B的表達與生存時間有關，提示Dyrk1B對判斷預后可能有一定幫助，因此臨床可以檢測Dyrk1B的表達輔助判斷預后，即高表達患者的預后較差，但其臨界值尚需要多中心、大樣本的數據進行初步敲定。本實驗免疫組化的結果經Western Blot的半定檢測得到驗證，同時顯示出Dyrk1B蛋白與mRNA表達具有一致性。Dyrk1B具有癌基因樣的作用，引起腫瘤異型增生明顯，細胞分裂速度增加。Dyrk1B參與腫瘤的形成是其經典作用，Dyrk1B參與腫瘤進展可能是通過對相關因子表達的調節實現的。Dyrk1B表達調控主要發生在基因轉錄水平。也有學者認為Dyrk1B可以引起上皮粘附素的低表達，使惡性腫瘤細胞間的連接松動，同時引起神經型粘附素的高表達，引起轉移灶細胞的異質型粘附作用增加，腫瘤定植能力提高，形成轉移灶［12］。腫瘤形成中具有一定的間質反應，主要表現為纖維化和炎細胞浸潤，這與Dyrk1B的表達升高直接相關，是腫瘤直接侵襲或種植的結果，常伴隨著明顯的炎癥反應，此種作用是持續性的。使Dyrk1B下調可以抑制腫瘤細胞的增殖作用，其作用可能是通過下調CyclinD1、P21實現的。

總之，Dyrk1B蛋白和mRNA在結腸腺癌組織中表達升高，是腫瘤形成和進展中重要的促進因素，檢測術后組織中Dyrk1B的表達對判斷預后有一定價值。