茶黃素預處理劑對樹脂-牙本質粘結面的初期和抗老化影響

徐炯園 黎紅

在樹脂-牙本質粘結修復中，脫礦后的牙本質表面暴露膠原纖維和牙本質小管，隨后樹脂滲透，形成樹脂-牙本質混合層，這是樹脂-牙本質粘結修復的基礎。但受制于臨床現實，樹脂無法完全覆蓋膠原支架，導致裸露的膠原網絡在內、外因素作用下降解［1-3］。其中最主要的是內源性基質金屬蛋白酶（MMPs）。為了延長樹脂-牙本質粘結修復體的使用壽命，現階段的研究熱點是對多種MMPs抑制策略進行應用探索［4］。在使用各類天然或人工合成的MMPs非特異性的酶抑制劑時，粘結界面的粘結強度、抗老化能力均會增加。作為一種天然起源的MMPs抑制劑［5-8］，茶黃素（TFs）同時也是一種具有苯駢卓酚酮結構的酚性色素，其具有抗菌消炎、抗病毒抗氧化、降低血脂（輔助用于治療心腦血管疾病）等多種生理功效，甚至在抗腫瘤治療方面也有一定的輔助療效。同時，TFs被證明在例如關節(jié)炎、牙周炎、抗膠原引起的血栓等由膠原降解而引起的疾病治療中起到了重要的作用。但對于TFs在口腔醫(yī)學的研究中，基本還局限于對于口腔軟組織的治療以及抗齲方面的作用，較少有對TFs在牙本質粘結修復方面作用的研究。本實驗通過微拉伸測試儀測量樹脂-牙本質粘結界面的微拉伸強度（TBS）［9］比較TFs對樹脂-牙本質粘結界面強度的影響，來為口腔醫(yī)學提供參考數據。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 慢速切割機（Isomet Buehler），游標卡尺（Blue·Point），微拉伸測試儀（Micro Tensile Tester/Bisco），人工唾液，高純度茶黃素，2%氯己定試劑，氯胺T，光固化樹脂（3M/ESPE Z350XT樹脂/光固化復合樹脂），Single Bond2（3M/ESPE Adper），37%磷酸酸蝕劑5ml（登泰克），氰基丙烯酸粘合劑（Zapit），掃描電子顯微鏡。

1.2 方法 （1）茶黃素預處理劑配置：將茶黃素溶于蒸餾水中，配置成20μmol/L濃度的茶黃素預處理劑，并用氫氧化鈣滴定至pH=7.2備用。（2）離體牙收集及實驗分組：在患者知情同意下，收集杭州口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診拔出的新鮮無齲壞第三磨牙，共48顆。刮匙刮去附著軟組織后隨機分成陰性對照組（A組）、陽性對照組（B組）和TFs預處理組（C組），每組各16顆離體牙，并浸泡于6.16g/L的氯胺T溶液中，4℃低溫保存。收集的離體牙在1個月內進行實驗使用。（3）即刻TBS測量基本過程：A、B、C三組，每組取出一半樣本進行實驗（8顆），見表1。（4）老化TBS測量基本過程：每組使用剩余一半樣本進行實驗（8顆），見表2。

表1 即刻TBS測量基本過程

表2 老化TBS測量基本過程

1.3 微拉伸試件制備及拉伸測試示意圖 見圖1。

圖1 微拉伸試件制備及拉伸測試示意圖

1.4 TBS測量及計算方式 將粘結試件用Zip膠水固定于微拉伸測試儀上以1mm/min的加載速度測試試件因拉伸斷裂時的最大荷載值（N），除以試件橫截面面積（mm），得到粘結強度（MPa），即TBS。

1.5 電鏡掃描 選取老化后微拉伸樣本進行干燥噴金，掃描電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法 收集整理各類粘結界面的斷裂模式，采用SPSS 25.0軟件對每次測量的TBS進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在試件拉伸時，各組都有若干試件斷裂面不在粘結界面上，因此要排除相應的數據。僅選取粘結界面破壞這種斷裂方式的進行研究分析。

2.1 對不同處理因素組間的差異進行比較 老化處理后無論何種處理方式，TBS均明顯下降（P＜0.001），見表1。

表1 對不同處理因素組間的差異進行比較［Mpa，（±s）］

表1 對不同處理因素組間的差異進行比較［Mpa，（±s）］

試驗分組 即刻TBS 老化TBS 差值 t值 P值n 均數±標準差 n 均數±標準差A組 42 18.99±2.77 50 11.85±2.19 7.14 13.808 ＜0.001 B組 45 21.98±2.42 50 15.69±2.40 6.28 12.682 ＜0.001 C組 45 18.72±2.26 49 13.44±2.74 5.29 10.160 ＜0.001

2.2 即刻TBS和老化TBS各試驗組之間的差異進行LSD多重比較 即刻拉伸實驗中，C組與A組無統(tǒng)計學差異（P=0.611），B組TBS大于A組和C組，且有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。老化實驗中，C組TBS小于B組（P＜0.001），大于A組（P=0.002）。見圖2。

圖2

2.3 掃描電鏡 掃描電鏡觀察粘結斷裂面可見，即刻試驗中（圖3，分別是A、B、C三電鏡下圖像），多數斷裂在混合層靠近粘結劑方向，斷裂面有樹脂覆蓋，未見牙本質暴露。在老化后粘結斷裂面電鏡掃描圖（圖4），可見多數斷裂于混合層下部，靠近牙本質界。（AR：粘結劑；D：牙本質；DT：牙本質小管；FN：管周纖維網；R：樹脂；RT：樹脂突）。

圖3 A、B、C三電鏡下圖像。a1：斷裂面主要在樹脂層；a2：高倍鏡下a1圖；b1：主要斷裂在混合層下部，靠近牙本質界；b2：高倍鏡下b1圖可見被樹脂深入牙本質小管形成錐形樹脂突，管周膠原纖維網保存較完整；c1：斷裂在混合層上部，帶有部分樹脂；c2：高倍鏡下c1圖

圖4 老化后粘結斷裂面電鏡掃描圖。a1：斷裂面主要在牙本質層；a2：高倍鏡下a1圖，可見牙本質小管，部分管內樹脂突缺如，管周膠原纖維網有斷裂；b1：主要斷裂在混合層下部，靠近牙本質界，部分斷裂在牙本質層；b2：高倍鏡下b1圖仍可見牙本質小管內的樹脂突，空隙較小，管周膠原纖維網不完整；c1：斷裂在混合層下部，部分斷裂在牙本質層；c2：高倍鏡下c1圖，牙本質小管內可見樹脂突，但已有間隙，管周膠原纖維網有斷裂

3 討論

MMPs抑制劑氯己定（chlorhexidine，CHX）已被廣泛應用于口腔治療中。相關文獻報道［10］，MMP-2、MP-8、MMP-9 的活性在 CHX 的作用下會受到抑制，其可以交聯牙本質小管管周的膠原纖維，并抑制MMPs 的作用，從而保證膠原纖維不被降解，使樹脂-牙本質粘結界面持久耐用。如今，CHX已成為口腔粘結中的金標準。TFs是茶葉中找到具有確切藥理作用的化合物，且具有廣泛的生物活性。在抑制MMPs活性的過程中有與CHX的相似之處，作為一種苯駢卓酚酮結構的酚性色素，TFs能與多種金屬離子形成絡合物結晶體，從而激發(fā)了TFs作為陽離子螯合劑的作用。TFs作為一種植酸有較強的二價金屬離子螯合性，尤其是在pH接近中性的情況下，TFs會與牙本質中的Ca2+、Zn2+等金屬陽離子螯合。而MMPs的活化，必須將酶活性區(qū)間的陽離子配基與牙本質中的Ca2+、Zn2+等金屬陽離子結合。因此，TFs能競爭性抑制MMPs的活性，從而保護樹脂-牙本質粘接界面，減緩其酶解老化過程。與MMPs 人工合成抑制劑CHX比較，TFs作為一種天然化合物，其螯合陽離子方式較為溫和，對牙周組織無毒、無刺激。

從電鏡掃描圖中可以看出TFs對牙本質膠原纖維降解活動有抑制作用，改善混合層粘結性能，從而延緩樹脂-牙本質粘結界面的老化。在未使用TFs或CHX的情況下其斷裂面牙本質明顯脫礦，牙本質小管空虛，膠原纖維斷裂。而使用TFs預處理儲存3個月的樣本，其斷裂面牙本質小管中有殘留樹脂突。而對于樹脂粘結劑，其與牙本質的固位力來源于樹脂突固位和化學固位。因此，使用TFs預處理牙本質面，有其應用前景。

本實驗結果表明，TFs起到了一定抑制牙本質MMPs和保護混合層的作用，這種作用需要≥3個月的時間來體現。減緩粘結強度下降即體現了TFs在樹脂-牙本質粘結界面抗老化方面的潛力。但是，TFs抑制牙本質中MMPs的分子機制、抑制效果、持續(xù)時限以及最適抑制濃度等問題都有待于進一步的研究。