復方青黛丸聯合MTX 治療銀屑病療效及機制研究

季天皓，陳軍毅，孟亞東

（1.上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院皮膚科，上海 202150；2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院檢驗科，上海 202150）

銀屑病是常見的慢性炎癥性皮膚病，病理改變主要為角質形成細胞過度增殖伴角化不全。目前認為，銀屑病發生、發展的主要機制是免疫細胞輔助性T細胞（helper T cell，Th）1和Th2的比例失調，并且Th1過表達促炎細胞因子如干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、白細胞介素（interleukin，IL）-12和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等[1-2]。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）是銀屑病的一線治療藥物，其機制主要是抑制免疫細胞活性，調節Th1和Th2細胞比例，但長期使用存在一定副作用。中成藥復方青黛丸主要成分有青黛、土獲、丹參、白術、建曲等，具有抗炎、鎮痛、止癢等作用。近年來，隨著臨床使用的增多，該藥已漸漸成為基層皮膚科治療銀屑病的首選藥物之一[3-4]，但對于中度以上銀屑病患者，往往需要聯合其他藥物一并使用，如MTX。銀屑病發生、發展的主要機制是Th1和Th2的失衡，目前尚不清楚復方青黛丸聯合MTX是否會通過降低IFN-γ、IL-12和增加IL-4等的表達來調節銀屑病中Th1占優勢的免疫狀態。因此，在本研究中，我們擬通過定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測復方青黛丸聯合MTX和單用MTX治療銀屑病患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中GATA-3、T-bet、IL-4、IL-12和IFN-γ的表達，明確復方青黛丸聯合MTX對銀屑病患者PBMC中Th1和Th2相關因子mRNA表達的影響，開展銀屑病患者Th1/Th2失衡狀態的臨床研究，評估臨床表型與Th1、Th2細胞因子表達之間的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

根據銀屑病患者皮損面積和嚴重程度指數評分（psoriasis area and severity index，PASI），選取評分＞10的尋常型銀屑病患者。排除有以下情況的患者：1型糖尿病；肥胖[體質量指數（body mass index，BMI）＞25]；心血管疾病；妊娠狀態；有肝病史或研究期間飲酒；外用過MTX；2個月內接受過光療；2個月內服用過復方青黛丸或非處方銀屑病治療藥物；因任何原因放棄參與本研究[5]。最終納入50例斑塊型銀屑病患者，其中男32例、女18例，年齡為21～59歲。

1.2 方法

以單用MTX治療者為對照組，復方青黛丸聯合MTX治療者為治療組。2個組受試者都經MTX治療，持續8周。在8周內，治療組的受試者同時服用復方青黛丸（3次/d，6 g/次）。在研究開始（基線）和結束時均通過PASI評分系統評估銀屑病嚴重程度。本研究將PASI-75設為閾值和臨床有效性指標[6]。此外，收集和統計受試者年齡、發病年齡、體質量、BMI和皮膚生活質量指數（dermatology life quality index，DLQI），DLQI主要通過皮膚病生活質量表評價2個組患者日常活動、癥狀、人際關系、工作和學習、感受情況等5項生活質量評分，分數越低說明患者生活質量越優。

1.3 分離PBMC

收集每例受試者4mL血液至乙二胺四乙酸采血管中。將血液樣品在室溫下放置60 min，然后以978×g離心20 min。使用Ficoll（比重：1.077）從血液樣品中分離PBMC。將分離的細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌2次。

1.4 實時熒光定量 PCR

通過實時熒光定量PCR測定T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12和IL-4的mRNA表達。使用Trizol（瑞士羅氏公司）從PBMC中分離總RNA。采用Prime-Script TM、RT試劑盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA。在ABI 7000熒光定量PCR儀（美國ABI公司）上進行定量實時PCR，引物及探針序列見表1。將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為樣品標準化的內源性對照。目標基因的表達對照GAPDH的表達以計算相對定量2-ΔΔCt，并將結果表示為倍數變化。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件及GraphPad Prism 6軟件進行統計分析。數據以±s的形式表達。采用Mann-Whitney檢驗或獨立樣本t檢驗來比較2個組之間轉錄因子和細胞因子的表達。Pearson相關檢驗用于評估PASI評分與Th1和Th2標記之間的相關性。用Spearman相關性檢驗以評估年齡、發病年齡、體質量、BMI、DLQI、T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12、IL-4表達之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 引物及探針序列

2 結果

2.1 治療組和對照組患者臨床特征

本研究將50例銀屑病患者分為2個組，對照組男17例、女8例，治療組男15例、女10例。2個組患者的性別、年齡、體質量和BMI差異均無統計學意義（P＞0.05）。對照組和治療組研究前PASI評分差異無統計學意義（P=0.70），治療8周后，治療組的PASI評分顯著低于對照組（P＜0.05）。對照組的8例受試者及治療組的12例受試者在第8周達到PASI-75（P＜0.05）。對照組與治療組在基線時及治療8周后DLQI差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 2個組患者臨床特征比較

2.2 Th1、Th2細胞及其相關細胞因子變化

對照組中Th1細胞及其相關細胞因子IFN-γ、IL-12和T-bet的mRNA表達均高于治療組（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05），見圖1。以PASI-75為閾值對照組和治療組之間的各Th1細胞因子表達差異進行研究。治療組中PASI評分變化＞75%的受試者IFN-γ的表達低于對照組（P＜0.05），同時也有更好的臨床改善。但治療組和對照組受試者之間IL-12和T-bet的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。治療組中IL-4和GATA3的表達高于對照組（P＜0.05），見圖2。PASI評分變化＞75%的治療組受試者GATA3及IL-4的mRNA表達高于同條件對照組受試者。Th2的GATA3及IL-4的表達與PASI評分變化之間差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，臨床表現的改善與IL-4及GATA3的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 對照組和治療組IFN-γ、IL-12和T-bet的相對基因表達

圖2 對照組和治療組IL-4和GATA3的相對基因表達

表3 對照組和治療組受試者之間IL-12和T-bet表達 ±s

表3 對照組和治療組受試者之間IL-12和T-bet表達 ±s

2.3 Th1、Th2細胞相關細胞因子變化與臨床特征的相關性

IFN-γ、IL-12、T-bet、IL-4及GATA3 mRNA的表達與年齡、發病年齡、體質量、BMI及DLQI之間均無相關性（P＞0.05）。見表4。

表4 對照組和治療組其他變量與細胞因子之間的相關性

3 討論

T-bet和GATA-3已被發現能影響Th細胞的分化。T-bet是T-box基因中Tbr1亞家族的成員，在Th1分化中起重要作用。T-bet控制Th1IFN-γ的表達，并抑制Th2 IL-4的產生，使平衡從Th2向Th1偏移。另外，Th2途徑GATA-3能促進Th2的分化及Th2相關細胞因子的表達。T-bet和GATA-3之間的相對表達會影響Th1/Th2途徑，目前已在數種免疫性疾病中發現了這個現象，包括特應性皮炎、類風濕性關節炎和銀屑病[7-8]。有報道提示，口服復方青黛丸會影響Th1和Th2細胞因子的表達，患者臨床表現與免疫通路的特異性調節有關[9]，當平衡傾向Th2時伴隨GATA3和IL-4表達的增加以及IFN-γ、IL-12和T-bet表達的減少。本研究結果與關于復方青黛丸作用的研究結果（促炎細胞因子表達降低，使平衡從Th1向Th2細胞途徑偏移）[10-12]一致。

本研究發現，PASI評分變化＞75%的患者的GATA3和IL-4的表達水平高于IFN-γ、IL-12和T-bet的表達水平。因此，我們認為臨床表現改善的患者常伴隨Th1因子下調和Th2因子上調。相較于健康人，銀屑病患者血清中IFN-γ表達更高，而IL-4表達更少，且IFN-γ水平與PASI評分相關。此外，使用復方青黛丸進行治療后，銀屑病患者血清IFN-γ水平降低的同時PASI評分也會減小。調節Th1/Th2平衡可能是通過T-bet和GATA-3介導的。有研究發現銀屑病患者的PBMC中Th1細胞因子表達更顯著，其中T-bet的mRNA表達高于健康人，而GATA-3的mRNA表達則低于健康人[11-13]。

綜上所述，復方青黛丸可能通過加強T淋巴細胞功能、參與先天性免疫應答的一種或多種組分，或通過阻斷銀屑病患者炎性細胞因子的活性來增強免疫應答。復方青黛丸通過抑制銀屑病患者促炎細胞因子IL-1、IFN-γ和TNF-α，同時增強Th2因子IL-4、IL-5的分泌來調節一部分免疫應答，本研究將復方青黛丸治療銀屑病的臨床表現及Th1/Th2免疫模式聯系起來，我們認為，復方青黛丸治療銀屑病是符合衛生經濟學發展的療法。然而，樣本量較少是本研究的不足之處，相關結果需要更多樣本并進行更大規模的研究數據來證實。建議進行更敏感的分析，如流式細胞術，以確定治療后銀屑病患者PBMC的相關亞群，或有助于進一步了解銀屑病的免疫機制。