CRISPR/Cas 系統在分子檢測中的應用

王雪亮，肖艷群，王華梁

（上海市臨床檢驗中心分子生物學室，上海 200126）

隨著分子生物學技術的飛速發展，分子檢測的應用范疇不斷擴大，目前已被廣泛應用于感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等多個領域，是疾病預防、診斷、治療、監測和預后評估的重要方法。目前，臨床常用的分子檢測技術主要分為3類：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、分子雜交技術和基因測序技術。這3類技術存在操作復雜、設備昂貴、人員需專業培訓等局限，因此開發更為快速、價廉、操作簡單、靈敏度高、特異性強的新一代檢測技術，是分子檢測領域不斷追求的目標[1-3]。

成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/成簇規律間隔短回文重復序列相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）系統是細菌和古細菌在生物進化過程中形成的一種適應性免疫防御系統[4]。目前，CRISPR技術作為基因組編輯利器，已被廣泛應用于生物、醫學、農業等多個領域[5-6]。此外，在科學家發現部分Cas（如Cas13和Cas12）具有“附帶切割”活性，并將其用于快速分子檢測后，此領域的發展立即駛入快車道，并取得系列重要成果[2,7]。我們就CRISPR技術在分子檢測中的相關應用展開綜述，以期為相關人員在此領域中進一步應用該技術提供參考與幫助。

1 CRISPR/Cas系統簡介

CRISPR/Cas系統本質上是一系列由RNA引導的核酸內切酶，存在于約40%的細菌和90%的古細菌中，是細菌抵御外源物質（如噬菌體和質粒）入侵的獲得性免疫系統[8]。1987年，ISHINO等[9]即在大腸埃希菌中發現了串聯的間隔重復序列，但其功能未知。2002年，JANSEN等[10]將此重復序列正式命名為CRISPR序列。CRISPR序列主要由前導區、重復序列和間隔序列組成，其上游富含AT堿基對，長度為100～500 bp，即CRISPR序列前導區，被認為是CRISPR序列轉錄的啟動子；重復序列長度為21～48 bp，含回文序列，可形成發卡結構；間隔序列位于重復序列之間，長度為25～72 bp，其序列來源于病毒或噬菌體等外源DNA[11]。2007年，BARRANGOU等[8]首次發現并證實了嗜熱鏈球菌可利用CRISPR系統抵抗噬菌體侵染。CRISPR系統行使功能主要包括3個階段：（1）適應階段。當外源核酸入侵細菌時，細菌啟動自身防御機制，將外源核酸整合到CRISPR回文重復序列中；（2）表達階段。CRISPR序列在RNA聚合酶幫助下進行轉錄，然后被剪切為成熟CRISPR RNA（crRNA）。成熟crRNA與反式作用crRNA相結合，形成向導RNA（single-guide RNA，sgRNA），發揮導向功能；（3）干擾階段。通過識別外源核酸序列中的前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），sgRNA引導Cas（如Cas9、Cas12、Cas13等）與靶標序列相互作用，引發對外源核酸的定向切割[12-13]。

根據Cas的組成及發揮功能的方式，CRISPR/Cas可分為二大類群：第1類以多個Cas組成的效應復合體行使功能為特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2類則只需單個多結構域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型[14-15]。第2類系統簡單、高效、操作方便，是目前主要的基因編輯系統，其中最具代表性的是Cas9。相比Cas9，Cas12a和Cas13a僅需crRNA即可實現特異性靶位點切割，這表明其系統更為簡潔，具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力[16-17]。

2 基于Cas9的分子檢測系統

CRISPR/Cas9系統具有精準識別和切割特定DNA序列的能力，這意味著其可用于新型分子檢測方法的開發。2016年，PARDEE等[18]首次將CRISPR/Cas9技術引入分子檢測中，他們將等溫toehold生物傳感檢測到的寨卡病毒和凍干CRISPR/Cas9相混合，肉眼觀察即可對寨卡病毒美洲株和非洲株進行準確分型（圖1）。ZHOU等[19]和HUANG等[20]利用CRISPR/Cas9的特異識別切割能力和等溫擴增技術相結合策略分別開發了CRISDA和CAS-EXPAR方法，可實現阿摩爾級的高靈敏度（amol/L，10-18mol/L）單堿基分辨率，并成功用于單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型和單增李斯特菌檢測。有學者將CRISPR/Cas9和PCR技術相結合，建立了具有較高靈敏度和特異性的不同版本的ctPCR技術，有效用于人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16型和18型的檢測和基因分型[21-23]。此外，LEE等[24]還利用Cas9/sgRNA的特異性切割結直腸癌患者血液中的野生型DNA，進而增加樣本中循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的豐度，可顯著提高ctDNA檢測的靈敏度和準確性，更好地用于腫瘤的早期診斷和用藥監測。然而，上述研究報道的基于Cas9的檢測方法主要還是作為輔助工具切割特定靶標序列，并未被直接應用于各種靶標序列檢測，這使得其在實際臨床工作中的推廣受到一定程度的限制。

圖1 CRISPR/Cas9用于寨卡病毒毒株分型[18]

3 基于Cas13的分子檢測系統

與常用Cas9不同，Cas13a（舊稱C2c2）是一種RNA引導的RNA核酸內切酶，屬于第2類CRISPR/Cas系統中的Ⅵ型[25]。Cas13a能在crRNA的引導下特異性切割單鏈靶標RNA，并在切割完成后仍保持活性，繼續切割其他非靶標RNA，即具有“附帶切割”能力[26]。基于此特性，EAST-SELETSKY等[27]開發出基于CRISPR/Cas13a檢測不同靶標RNA的新方法，但其靈敏度較低，不具有實際臨床應用價值。2017年，張峰開發了特異性高靈敏度酶解報告基因解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing，SHERLOCK）檢測系統[28]。在該系統中，目標模板首先經重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）（用于檢測DNA靶標）或逆轉錄-RPA（用于檢測RNA靶標）為含有T7啟動子的DNA模板，后經T7 RNA聚合酶逆轉錄，產物可作為Cas13a切割的靶標，在Cas13a對上述靶標特異性切割后激活附帶切割功能，切割體系中單鏈RNA熒光報告探針能產生可被檢測的熒光信號（圖2）[28]。相比先前的研究，PRA方法的引入顯著提高了該方法的檢測靈敏度，已被成功用于寨卡病毒、登革熱病毒、致病細菌株及其耐藥基因、SNP分型和ctDNA等多種靶標檢測。此外，該方法所用檢測試劑可凍干制備成濾紙片，用于即時檢測（point-of-care testing，POCT），成本極為低廉（0.61美元/次）[28]。在此基礎上，該團隊很快開發出第2代SHERLOCK（SHERLOCKv2）系統，在性能方面有了較大提升：（1）單管中可同時進行4通道檢測；（2）定量檢測限可低至2 amol/L；（3）結合Csm6蛋白可進一步將靈敏度提高3.5倍；（4）側向層析試紙條檢測，有效解決了上一代系統檢測通量低、不能定量、需特定熒光設備等問題[29]。此外，MYHRVOLD等[30]開發了改良版的SHERLOCKv2系統，命名為（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON）。此方法可不經核酸提取純化，僅需對臨床樣本進行核酸酶滅活和加熱等快速處理，即可用于后續SHERLOCK2反應，2 h不到便可肉眼觀測寨卡病毒和登革熱病毒的檢測及分型結果，其快速、價廉、準確的特點非常適用于POCT等應用場景[30]。

圖2 CRISPR/Cas13a分子檢測示意圖[28]

在上述重磅研究成果被報道后，多個課題組進一步拓展了Cas13a在不同分子檢測領域的實際應用。WU等[31]、LIU等[32]和QIN等[33]分別報道了CRISPR/Cas13可用于EB病毒、H7N9禽流感病毒和埃博拉病毒等感染性病原體的準確、快速檢測。此外，CRISPR/Cas13結合微流控芯片技術可實現樣本檢測的全自動化，具有重要的臨床應用價值[33]。SHAN等[34]的研究結果證實采用基于CRISPR/Cas13a的方法可在30 min內準確定量樣本中的miRNA。

4 基于Cas12的分子檢測系統

Cas12a（舊稱Cpf1）屬于第2類CRISPR/Cas系統中的Ⅴ型，由ZETSCHE等[35]在2015年進行特性鑒定，并成功用于人細胞基因組編輯。與Cas9類似，Cas12a是RNA引導的特異性DNA核酸內切酶。已有研究結果表明，Cas12a具有類似Cas13a的附帶切割特性，但其非特異性切割的靶標是單鏈DNA，并利用此特性開發了基于Cas12a的分子檢測平臺——DETECTR[36]。與SHERLOCK工作原理相似，為提高方法的檢測靈敏度，DETECTR利用RPA等溫擴增靶標DNA，擴增產物與Cas12a/cRNA混合后啟動特定靶標切割，并激活Cas12a的附帶切割活性，反應體系中DNA熒光報告探針即可釋放熒光信號（圖3）[36]。DETECTR可在短短1 h內準確檢測臨床患者樣本中的HPV16和HPV18準確檢測并分型。同一時期，LI等[37]也報道了與DETECTR類似的基于Cas12a的分子檢測方法，稱為HOLMES。HOLMES與DETECTR的主要不同之處是前者使用RPA對目的片段進行擴增，而未使用RPA方法。HOLMES可靈敏、特異、快速地實現SNP分型、DNA病毒和RNA病毒的檢測[37]。

圖3 CRISPR/Cas12a分子檢測示意圖[36]

此外，同樣屬于第2類CRISPR/Cas系統Ⅴ型的Cas12b（C2c1）也被證明具有附帶切割活性，LI等[38]利用其特性開發了基于Cas12b的分子檢測平臺HOLMESv2。與上一代HOLMES不同，HOLMESv2將環介導等溫擴增技術和Cas12b檢測相結合，二者相同的反應溫度使檢測系統可有效整合，從而實現快速、準確的一體化檢測，并被成功用于1 h內快速檢測乙型腦炎病毒[38]。

5 基于Cas14的檢測系統

與Cas12a相同，新近鑒定的Cas14同屬第2類CRISPR/Cas系統中的Ⅴ型，是RNA引導的特異性D N A 核酸內切酶，同時具有針對單鏈DNA的附帶切割活性[39]。不同的是，Cas14a與靶標結合的特異性比Cas12a更高，因而更適用于開發需達到單堿基分辨率的檢測方法。HARRINGTON等[39]建立了基于Cas14a的DETECTR檢測方法，并成功用于人類眼色HERC2基因SNP分型（圖4）。然而，sgRNA引導的Cas14a僅能靶向切割單鏈DNA，故在檢測時需先將擴增后的雙鏈DNA的1條鏈降解，以生成靶標單鏈DNA，才能用于后續檢測，這在一定程度上增加了操作的復雜性。

圖4 CRISPR/Cas14a分子檢測示意圖[39]

6 小結與展望

CRISPR技術在短短幾年時間內飛速發展，已逐漸演變為一種功能強大的多用途生物學工具。目前，CRISPR/Cas系統在分子檢測領域中的應用才剛剛開始，但SHERLOCK和DETECTR等方法已展現出良好的臨床應用價值與前景。作為新型“下一代分子診斷”技術，其具有快速、便攜、成本低廉、靈敏度高、特異性強等優點，已被證明可用于病原體檢測、耐藥性分析、SNP分型、腫瘤基因突變檢測等多個方面令，特別適用于野外環境或基層醫院。但是，基于Cas13a的檢測需使用RNA熒光報告基團，其易受環境中RNA酶降解，可能出現假陽性結果。相對而言，使用DNA熒光報告基團的基于Cas12的檢測方法則不易受此問題影響。此外，單獨使用Cas檢測的靈敏度偏低，現有CRISPR檢測方法均需擴增相應目標核酸以提高檢測靈敏度。為解決此問題，未來需挖掘更多新型Cas并建立更為簡單、有效的CRISPR/Cas檢測方法。目前報道的CRISPR檢測方法尚處于實驗室開發階段，在臨床工作中的實際作用如何尚需進一步評估，以確保其具有良好的臨床適用性。總之，隨著新的Cas的不斷發現及相關研究的持續深入，CRISPR/Cas系統勢必會對分子檢測技術的發展和應用產生深遠影響。