艱難梭菌二元毒素A 的原核表達及免疫原性分析

黃穎鳳，林雪霏，黃歡歡，吳愛武

（廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東 廣州 510182）

艱難梭菌是產芽孢的革蘭陽性桿菌，屬于梭狀芽孢桿菌屬中的專性厭氧菌[1]。艱難梭菌主要的致病因子為毒素A和毒素B，一部分高產毒的艱難梭菌還可以產生二元毒素（Clostridium difficilebinary toxin，Cdt），該毒素由CdtA和CdtB 2個獨立的蛋白亞基組成，其中CdtA具有酶活性，CdtB具有結合能力[2-3]，Cdt具有肌動蛋白特異的二磷酸腺苷核糖基轉移酶活性，可導致細胞骨架解聚[4]，產Cdt的菌株可使毒素A表達量提高到約為普通菌株的16倍，毒素B表達量提高到約為普通菌株的23倍[5]，從而產生更強的致病性，導致更高的死亡率。艱難梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI）主要表現為不同程度的腹瀉和偽膜性腸炎[6]。2003年以來，北美、歐洲等地區CDI發病率和病死率明顯增加，這與曾暴發流行的RT 027型艱難梭菌以及一小部分RT 078型高產毒CDI有關[5]。除此之外，暴發流行的艱難梭菌菌株還有RT 017、RT 018、RT 106、RT 176和RT 244型。2008年，我國香港首次報道發現高產毒的RT 027型艱難梭菌菌株[7]，但目前尚未見全國性CDI流行病學調查分析結果的報道，因歐洲和北美洲高產毒艱難梭菌菌株暴發感染的前車之鑒[8]，分泌Cdt的高產毒艱難梭菌菌株之潛在危害不可小覷。目前，抗菌藥物治療CDI復發率高達20%[9]，為了防止艱難梭菌引起的大規模CDI暴發，給易感患者接種艱難梭菌疫苗是最理想的方法，該疫苗接種最適用于計劃住院治療、需要長期護理、入住養老院和需要長期或高頻率服用抗菌藥物的人群，但經過20多年的研究，目前仍無被批準上市的艱難梭菌疫苗[10-11]。本研究以可引起CDI暴發流行的、能產生Cdt的艱難梭菌為研究重點，對CdtA的原核表達及免疫原性進行初步探究。

1 材料和方法

1.1 菌種來源及試劑

pET-28b質粒保存菌種及包被96孔板的CdtA（C129-1392）蛋白由廣州醫科大學金域檢驗學院實驗室構建并保存；艱難梭菌RT 027型菌株DNA由加拿大圭爾夫大學Scott博士惠贈；大腸埃希菌BL21感受態細胞、小劑量質粒提取試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶、Premix Taq聚合酶等購自大連TaKaRa公司；羊抗鼠IgG二抗-HRP購自中國臺灣arigo公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電化學發光（electrochemical luminescence，ECL）曝光試劑盒購自美國Millipore公司；弗氏完全、不完全佐劑購自美國Sigma公司。實驗中所用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物合成及基因測序由上海英濰捷基有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成 根據GenBank上的cdtA基因全長序列，利用Primer Premier軟件設計引物，并在上下游引物5'端分別添加限制性內切酶及其保護堿基。上游引物為5'-CATGCCATGG GC AAAAAATTTAGGAAACATAAAAGGATT-3'（斜體字母為保護堿基，下劃線部分為NcoⅠ限制性內切酶，加框部分為補齊堿基），下游引物為5'-GCGCAAGCTTAGGTATCAATGTTTGCA TCAACAATTAA-3'（斜體字母為保護堿基，下劃線部分為HindⅢ限制性內切酶）。

1.2.2 PCR擴增cdtA全長序列 以RT 027型艱難梭菌DNA為PCR模板，按大連TaKaRa公司的高保真酶PremixSTAR HS的使用方法設定PCR循環條件，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，初步鑒定擴增結果。

1.2.3 pET-28b-cdtA原核表達載體的構建 純化后的PCR產物與pET-28b載體分別經NcoⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，導入大腸埃希菌BL21感受態細胞，涂布于kana/LB/X-Gal平板，隨機挑取23個白色菌落，分別增菌后用pET-28b載體的通用引物T7和T7ter行菌液PCR，選取陽性菌株測序。

1.2.4 His-CdtA重組蛋白的表達 取構建成功的pET-28b-cdtA表達菌株大量增菌，誘導蛋白表達，探索可溶性重組蛋白大量表達的最佳條件。當菌液達到對數生長中期[600 nm處吸光度（A）值=0.6]時，搖床溫度分別設定為25 ℃、30 ℃、37 ℃；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）濃度分別為0、0.5、1.0和1.5 mmol/L，時間分別為8、10和12 h；同時設立pET-28b空載體為陰性對照，分別收集不同條件下誘導的菌液，1 789×g離心15 min，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，沉淀后置冰盒超聲破碎，4 ℃、13 684×g離心15 min分離蛋白上清和沉淀，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，確定His-CdtA重組蛋白的最佳表達條件。

1.2.5 His-CdtA重組蛋白的純化及鑒定 用最佳誘導條件大量誘導His-CdtA蛋白表達，利用鎳柱親和層析法，通過調節A液（磷酸鹽緩沖液）和B液（500 mmol/L咪唑）比例，使咪唑濃度分別為10、50、100、200和300 mmol/L，探索His-CdtA重組蛋白的最佳純化條件，SDS-PAGE驗證表達及純化結果。同時設立相同誘導條件下的pET-28b空載體表達蛋白陰性對照。

1.2.6 動物免疫 將純化后的His-CdtA重組蛋白按100 μg/只給予6周齡的雌性Balb/c小鼠右后腿肌注，同時設立磷酸鹽緩沖液陰性對照。分別在第1、7和14天進行小鼠免疫，首次免疫將His-CdtA重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻，第2、3次免疫將His-CdtA重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混勻。最后1次免疫10 d后收集小鼠血清，分析抗CdtA抗體滴度。

1.2.7 His-CdtA重組蛋白的抗原性分析 將實驗室保存的CdtA（C129-1392）重組蛋白按2 ng/μL包被96孔板，4 ℃包被過夜，分別加入100 μL按1∶102、1∶：103、1∶104和1∶105稀釋的小鼠血清，做2個復孔，37 ℃孵育2 h后洗5次，加入100 μL按1∶104稀釋的羊抗鼠IgG二抗-辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），37℃孵育1 h后洗5次，加入四甲基聯苯胺顯色液避光15 min后加入終止液，測450 nm處的A值。

1.2.8 His-CdtA重組蛋白的免疫印跡法鑒定 純化后的His-CdtA重組蛋白經SDS-PAGE后經電轉膜至PVDF膜，3%牛血清白蛋白封閉1 h，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液洗3次，以加入1∶500稀釋的免疫后的小鼠血清為一抗，4 ℃振蕩孵育過夜后洗3次，加入1∶104羊抗鼠IgG二抗-HRP，室溫振蕩孵育1 h后洗4次，加入混勻后的ECL工作液，在ECL呈像儀上曝光并保存結果。

2 結果

2.1 PCR擴增cdtA全長序列

將以RT 027型艱難梭菌菌株為模板的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在1 000～1 500 bp處有1條特異條帶，序列大小與cdtA理論值1 392 bp相符。見圖1。

圖1 cdtA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 菌液PCR鑒定pET-28b-cdtA擴增產物

隨機挑取23個白色單菌落行菌液PCR，結果見圖2。由于通用引物T7、T7ter包括載體自身片段約200 bp，故PCR擴增產物會比cdtA的理論值大，位于1 500 bp左右。選取14號菌為代表，測序后經Blast比對與GenBank上的艱難梭菌CdtA的序列100%匹配（登錄號為HQ639678.1）。

圖2 菌液PCR鑒定pET-28b-cdtA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 His-CdtA重組蛋白的最佳表達條件

當培養物A600達到0.6時，調節搖床溫度為37 ℃，IPTG濃度為0，160 r/min 振蕩培養12 h，此條件下的上清液在相對分子質量45 000上方有較多的蛋白表達，且根據遷移率計算該蛋白大小與His-CdtA重組蛋白的理論相對分子質量53 000相符（圖3、圖4），而陰性對照（泳道9）不表達（圖3）。

2.4 His-CdtA重組蛋白的純化

收集各濃度咪唑洗脫液行SDS-PAGE（圖5）。上樣穿透液（泳道2）目的蛋白明顯減少，說明His-Cdt A重組蛋白已成功與鎳柱結合，當洗脫液咪唑濃度為10 m mol/L時能有效洗脫雜蛋白（泳道3），直到濃度達到200 mmol/L時才能成功洗下目的蛋白（泳道6）。最終確定本研究His-CdtA重組蛋白的最佳純化條件為：咪唑濃度為10 mmol/L時洗脫雜蛋白，咪唑濃度為200 mmol/L時完全洗脫His-CdtA目的蛋白。另外，pET-28b自身攜帶His標簽，用相同條件表達純化后雖然也有低濃度的蛋白被純化，但與His-CdtA目的蛋白大小不一致（圖4），進一步驗證His-CdtA重組蛋白非載體自身表達蛋白。

圖3 誘導pET-28b-CdtA蛋白表達產物的SDS-PAGE圖

圖4 鎳柱親和層析純化產物的SDS-PAGE圖

圖5 重組菌與空白載體的表達蛋白純化產物的SDS-PAGE圖

2.5 His-CdtA重組蛋白的抗原性分析

免疫3次后的小鼠血清抗CdtA抗體效價達到1∶104。見表1。

表1 His-CdtA重組蛋白的抗體滴度分析

2.6 His-CdtA重組蛋白的Western blot鑒定

免疫后的小鼠血清與純化后的His-CdtA重組蛋白可特異性結合，而對應大小的pET-28b表達蛋白無此現象。見圖6。

圖6 His-CdtA重組蛋白的Western Blot鑒定結果

3 討論

艱難梭菌可引起艱難梭菌相關性感染（Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD），是目前唯一能引起院內感染的革蘭陽性厭氧芽孢梭菌，約25%的抗菌藥物相關性腹瀉、75%的抗菌藥物相關性腸炎和約100%的假膜性腸炎均由此菌引起[12]。我國曾有1例老年患者感染RT 027型艱難梭菌導致休克的報道[13]，2018年的1篇文獻也報道了在分離自我國老年人群的116株艱難梭菌中發現1株RT 027型和6株RT 078型高產毒艱難梭菌[14]，提示老年人群中存在高產毒艱難梭菌暴發感染的潛在風險，與非高產毒艱難梭菌比較，更嚴重、更易復發且預后差，但目前我國對艱難梭菌Cdt的研究非常少，更缺少可用的疫苗，故針對高產毒艱難梭菌菌株毒素抗原性的研究和疫苗的研制對預防艱難梭菌暴發感染十分重要。本研究成功構建了CdtA的全長基因（1 392 bp）原核表達載體pET-28b-CdtA，重組序列測序結果與GenBank中的CdtA序列（登錄號為HQ639678.1）100%符合。實驗中經誘導產生的可溶性His-CdtA重組目的蛋白通過鎳柱親和層析的方法純化產物的相對分子質量為45 000～66 200，根據遷移率計算≈CdtA理論值（53 000），純化的His-CdtA免疫小鼠后產生了高效價的抗CdtA抗體，經免疫印跡法鑒定，能與免疫后的小鼠血清特異結合，這些研究為后續相關蛋白單克隆抗體的制備和疫苗的研制奠定了基礎。由于目前尚無商品化的艱難梭菌CdtA標準蛋白，本研究利用實驗室保存的、以能產Cdt的標準菌株艱難梭菌（ATCCBAA-1870）為PCR模板構建pET-28b-CdtA（C129-1392）質粒，以表達并純化的重組CdtA（C129-1392）作為標準蛋白包被96孔板，結果顯示，小鼠產生的抗CdtA抗體的特異性和編碼包被96孔板的本實驗室保存的重組蛋白CdtA（C129-1392）的DNA來自產Cdt的標準菌株艱難梭菌（ATCC-BAA-1870），與本研究誘導制備的His-CdtA的DNA模板（加拿大圭爾夫大學Scott博士惠贈）的RT 027型艱難梭菌菌株的DNA來自不同菌株，二者雖多肽鏈片段長度有差異，但CdtA（C129-1392）與His-CdtA含有相同的抗原表位。本研究結果顯示，本實驗室保存的重組蛋白CdtA（C129-1392）能與實驗中小鼠產生的抗CdtA抗體結合，間接驗證了本研究誘導表達的CdtA重組蛋白His-CdtA的抗原特異性。由于目前尚無商品化的抗CdtA特異性一抗，Western blot實驗結果顯示，小鼠免疫后的血清與實驗純化的His-CdtA重組蛋白可特異性結合，進一步說明本研究的蛋白純化產物為艱難梭菌CdtA。后續可考慮用His-CdtA刺激小鼠，制備相應的單克隆抗體，為Cdt的實驗室檢測及疫苗研制奠定基礎。