枸杞酒發酵過程中的褐變

郭曉夢，張一晟，王 菁，張惠玲*

（1.寧夏大學 農學院 寧夏銀川750021；2.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏銀川750021）

枸杞（Lycium barbarum）富含多種生物活性物質，具有較好的營養價值和藥理活性，是我國傳統藥食兩用的名貴中藥材[1-2]。枸杞發酵酒是以枸杞為原料，經酵母菌發酵而成的一種保健果酒，營養豐富，深受消費者喜愛[3]。但是枸杞酒容易發生褐變，不僅對色澤和風味造成影響，同時會降低營養價值[4]，制約著枸杞酒行業的發展。目前，我國對于枸杞酒的研究多集中于制作工藝及產品開發[5-7]，對枸杞酒褐變的研究十分少。作者針對枸杞酒制備中發生褐變因素進行研究，為進一步控制枸杞酒的色澤變化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

鮮枸杞：寧夏百瑞源股份有限公司；釀酒活性干酵母Excellence XR：法國Lamothe-Abiet公司；五羥甲基糠醛、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、沒食子酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚、冰乙酸、甲醇：均為HPLC，純度≥99%，北京中科質檢生物技術有限公司；福林試劑、沒食子酸、愈創木酚：均為AR，麥克林公司；鄰苯二酚、2，6-二氯酚靛酚、3，5-二硝基水楊酸、乙酸乙酯、VC：均為AR，北京奧博星生物技術有限責任公司。

儀器與設備：高效液相色譜儀1100 Series，美國安捷倫科技有限公司；紫外可見分光光度計V-5100，上海精科實業有限公司；旋轉蒸發儀RE-52，上海亞榮生化儀器廠；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞酒的制作流程鮮枸杞→清洗→破碎、打漿→添加亞硫酸→加入果膠酶、酶解→調節糖酸→過濾→接種酵母→發酵（18℃）→取上清液→陳釀→過濾→灌裝→成品酒。

1.2.2 操作要點枸杞汁預處理：將鮮枸杞清洗、瀝干后，以料水質量體積比1∶3打漿，加入亞硫酸，使SO2的質量濃度達到60 mg/L。加入40 mg/L果膠酶，45℃酶解4 h，調節糖度至20°Bx，調pH 3.3～3.5，過濾取汁發酵。

接種發酵：將活化后的酵母菌按0.2 g/L接入枸杞汁中，于18℃恒溫培養箱中發酵。每天定時取樣，測定相關參數，當糖質量濃度不再下降時停止發酵，取上清液進入陳釀，測定各項指標作為陳釀初酒指標。

陳釀：枸杞酒在16℃恒溫條件下陳釀90 d，每15天取樣并測定各項指標。由于陳釀中的酶活很小，實驗主要針對非酶褐變因子進行測定。

1.2.3 測定方法pH值：pH計測定；酒精體積分數：密度瓶法，參照《GB/T 15308 2006葡萄酒、果酒通用分析方法》[8]進行測定；還原糖：采用3，5-二硝基水楊酸法[9]；VC的測定：采用2，6-二氯酚靛酚法，參照GB 5009.86-2016進行測定[10]。PPO和POD活性的測定：PPO和POD的提取和測定參照趙鳳[11]等人方法；總黃酮的測定：采用分光光度計法，參照王靜[12]的方法。

褐變度的測定：采用消光值法[13]。將枸杞酒待測液在420 nm波長處測定吸光度值，用來表示褐變，吸光值越大，褐變越嚴重。重復測定3次。

游離氨基酸的測定：氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）測定。

總酚的測定：采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒食子酸計，所繪制標準曲線為：y=10.81x+0.091 1，R2=0.998 3。樣品總酚測定：將1 mL待測液稀釋10倍，取1 mL稀釋樣液進行測定。

酚類物質質量濃度測定：采用高效液相色譜法。取30 mL枸杞酒，參照李朋亮[15]的方法對樣品進行處理后上機測定。10種酚類物質標準品色譜圖見圖1，采用外標法所得10種酚類物質工作曲線方程見表1。

圖1 10種單體酚類物質標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 phenolic compounds

表1 10種單體酚類物質標準品工作曲線的回歸方程Table 1 Equation of liner regression of 10 phenolic compounds

5-HMF的測定：采用HPLC方法，稱取5-HMF標準品0.010 g，V甲醇∶V水=1∶1，定容至100 mL容量瓶，作為標準品溶液。取待測液20 mL，用20 mL乙酸乙酯萃取3次，收集有機相，35℃下旋轉蒸干后用2 mL甲醇-水（體積比1∶1）溶解，0.45μm有機濾膜過濾后進樣。

液相色譜條件為：柱溫30℃，檢測波長284 nm，流動相A為甲醇，B為V乙酸∶V水=1∶99，等梯度洗脫，流量為1.0 mL/min。樣品進樣前經0.45μm有機濾膜過濾，進樣量為20μL，檢測時間30 min。

HMF標準品色譜圖見圖2，所得標準曲線為：y=8 055.8x＋36.624，R2=0.999 9。

統計分析方法：使用SPSS17.0對陳釀過程中主要非酶褐變因素與褐變度進行通徑分析，分析前對數據進行標準化處理。

圖2 5-HMF標準品色譜圖Fig.2 Chromatography of 5-HMF standard

1.2.4 建立枸杞酒褐變模擬體系枸杞酒是一個復雜的體系，在分析陳釀中的褐變因素時，多因素交叉，為了證明實驗所得褐變因素的正確性，作者擬通過構建模擬體系進行驗證。以葡萄糖作為實驗中的還原糖，原始物質質量濃度以枸杞酒陳釀中第一次取樣為準。以枸杞酒中各游離氨基酸、總糖、還原糖、總酚包括黃酮、10種酚類物質、VC和5-HMF為指標，與褐變度（A420）進行通徑分析，研究其非酶褐變主要影響因素。為了便于觀察，模擬參數設計是在原酒的數據上擴大了10倍，配制乙醇檸檬酸緩沖液（11.64%乙醇，pH 3.22），將各模擬體系于50℃存放20 d，每5天取樣，測定其褐變度的變化，見表2。

表2 枸杞酒模擬體系的構建Table 2 Construction of medlar wine model system

2 結果與分析

2.1 發酵過程中褐變度影響

2.1.1 酶促褐變因素對褐變度的影響

1）酶與總酚的影響 從圖3可以看出，兩種酶與總酚在進入最旺盛階段變化較大，酶促褐變與非酶褐變共同參與，使褐變度一直上升，說明發酵過程中一直伴隨著褐變反應。枸杞中含有豐富的酚類物質，酚類中的一元酚鄰位羥基物質容易被PPO催化，形成鄰二酚并發生脫氫反應，生成具有高度氧化活性的鄰醌，鄰醌通過自身聚合或與多酚、蛋白質、金屬離子等結合發生共呈色作用，生成導致顏色越來越黃的多聚體，并最終形成不溶性的褐色多酚—黑色素，使枸杞酒的黃化發展為褐化。

圖3 發酵過程中酶、總酚與褐變度的變化Fig.3 Changes of enzymes，total phenolic and browning during wine fermentation

2）主要單體酚對褐變度的影響 蘆丁是枸杞中含量最高的類黃酮物質，其次是綠原酸和阿魏酸。從圖4—5可知，這些物質下降幅度較大。因為蘆丁結構苯環上含有4個羥基，其中包括2個鄰羥基，容易被PPO催化，形成醌類物質或與醌類物質縮合引起褐變；蘆丁具有較強的金屬離子螯合能力，能與Fe2+等金屬離子發生螯合反應，生成黃色、藍綠色和黑色等有色螯合物[16]，從而加速枸杞酒的褐變。槲皮素含有5個羥基包括2個鄰位羥基，其酶促褐變反應活性與蘆丁相似。山奈酚不含鄰羥基，發酵過程中可能是發酵液環境變化使細胞釋放。

圖4 發酵過程中類黃酮主要單體酚變化Fig.4 Changes of major phenolic compounds in flavonoid during wine fermentation

圖5 發酵過程中非類黃酮主要單體酚變化Fig.5 Changes of major phenolic compounds in nonflavonoid during wine fermentation

2.1.2 非酶促褐變因素對褐變度的影響枸杞中的非酶褐變主要來自VC氧化、還原糖和氨基酸的美拉德反應。由圖6可知，枸杞發酵液中VC從開始就迅速氧化降解，隨著發酵后期溶解氧被酵母菌大量消耗，以及多酚類物質和VC競爭式的氧化還原平衡，能一定程度保護VC，使VC下降速度變得緩慢。VC分子中含有連烯二醇基[-C（OH）=（OH）-]和內酯環結構，極易氧化分解形成脫氫抗壞血酸，經脫水形成DKG（2，3一二酮古洛糖酸）后，脫羧產生酮木糖，最終生成還原酮，進一步脫水與氨基化合物縮合或自身裂解，最終形成類黑精[17]，使枸杞酒褐變度上升。

圖6 發酵過程中VC、5-HMF與褐變度的變化Fig.6 Changes of VC，5-HMF and browning degree during wine fermentation

5-HMF是還原糖和氨基酸進行美拉德反應的中間產物，它的生成量能一定程度指示美拉德反應的進行。還原糖和氨基酸經1，2-烯醇化反應，脫水形成3-脫氧奧蘇糖，繼續脫水生成5-HMF，最終產物主要為類黑素[18]。從圖6可以看出褐變曲線一直上升。

2.2 陳釀過程中褐變度的影響

2.2.1 總酚與褐變度的變化由圖7可知，隨著陳釀時間的延長，褐變不斷產生。陳釀中除了多酚氧化聚合、VC氧化降解和美拉德反應的持續外，多酚氧化中間物質醌類還可以與酚等物質通過親核、偶聯或自由基途徑發生非酶聚合，反應過程中產生的二聚體或多聚體可能發生了結構重排，產生褐色的多聚體[19]也使得總酚物質下降。

圖7 陳釀過程中褐變度和總酚的變化Fig.7 Changes of browning degree and total phenolic during wine aging

2.2.2 主要單體酚的變化在陳釀中，枸杞酒中主要的單體酚蘆丁、綠原酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸和沒食子酸質量濃度均有下降，其原因與發酵過程相同，見圖8—9。

圖8 陳釀過程中類黃酮中主要單體酚變化Fig.8 Changes of major phenolic compounds in compounds flavonoids during wine aging

圖9 陳釀過程中非類黃酮主要單體酚變化Fig.9 Changes of major phenolic in non-flavonoid during wine aging

2.2.3 游離氨基酸的變化由表3可知，除了Asp和Gly質量濃度增加了，其他氨基酸都有所下降，脯氨酸下降最大，有研究表明[20]，脯氨酸最具類黑精形成活性，是褐變反應活性最高的氨基酸。錢敏[23]等人發現，谷氨酸參與的美拉德反應產物中5-HMF質量濃度較高。

表3 陳釀90 d后氨基酸的變化Table 3 Changes in amino acids after 90 days of aging

2.2.4 總糖、還原糖、5-HMF和VC的變化通過5-HMF與VC的變化可知，陳釀中的美拉德反應一直在進行，VC一直在持續，褐變一直在繼續。由圖10—11可知，枸杞酒陳釀過程中總糖呈不斷下降趨勢，還原糖先上升后波動下降。總糖發生酸水解使酒中多糖等非發酵性殘糖轉化為葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖等，使還原糖質量濃度有所升高，該還原糖參與美拉德反應被不斷消耗，使還原糖、總糖曲線有所下降。

圖10 陳釀過程中總糖、還原糖的變化Fig.10 Changes of total sugars and reducing sugars during wine aging

圖11 陳釀過程中VC和5-HMF的變化Fig.11 Changes of VC and 5-HMF during wine aging

2.3 通徑分析結果

通徑分析是建立在通徑系數概念基礎上的一種多元統計分析方法[21]。以總酚（X1）、總糖（X2）、5-HMF（X3）、VC（X4）為自變量，以褐變度A420為Y值，進行通徑分析。對褐變度進行S-W測試，統計量為0.934，p=0.583＞0.05，接近正態分布。采用逐步回歸分析法，篩選出對褐變度影響顯著的因素，得到最優回歸方程：Y=5.809-0.853X1-0.667X2，由顯著性檢驗可知：X1、X2顯著性均小于0.05，且模型達極顯著水平（F=266.498，p=0.000），相關系數R=0.996，說明方程擬合度達到99.6%，R2=0.993，剩余因子值很小，對褐變度有影響的自變量考慮較為全面。

由表4可知，總酚（X1）、總糖（X2）和VC（X4）與褐變度呈顯著負相關，5-HMF（X3）與褐變度呈顯著正相關。

表4 相關及顯著性檢驗結果Table 4 Correlation and significance test results

由表5可知，總酚對枸杞酒褐變度的直接通徑系數為P1=-0.682，對R2的總貢獻為0.669，總糖對枸杞酒褐變度的直接通徑系數P2=-0.345，對R2的總貢獻為0.323，說明總酚、總糖對褐變度具有直接的負效應。可以看出，總酚對褐變度起直接作用，總糖對褐變度起間接作用。有研究表明，酸性環境中，糖類容易轉變成羥甲基糠醛類中介物，然后與酚類物質反應生成有色物質，引起枸杞酒的褐變[22]。

表5 各褐變因素與褐變度通徑分析表Table 5 Path analysis of browning factors and browning degree

2.4 模擬實驗結果

2.4.1 不同酚類物質對褐變度的影響由圖12可知，M3（蘆丁）和M4（綠原酸）的褐變度明顯高于M1（不含酚），20 d后褐變度分別為M1的1.67和1.28倍，M2（對羥基苯甲酸）的褐變度較M1無明顯變化。蘆丁和綠原酸是引起陳釀中非酶促褐變的主要物質。另外，有研究表明，多酚和賴氨酸、葡萄糖的交互作用能夠促進褐變[23]，枸杞酒中有可能也發生了類似的反應。對羥基苯甲酸對枸杞酒陳釀中的褐變幾乎無影響，其作為羥基苯甲酸衍生物，在陳釀過程中質量濃度的降低可能是與酒精結合所致[24]。

圖12 不同酚類物質模擬體系褐變度的變化Fig.12 Changes of browning degree of different phenolic compounds model system

2.4.2 不同氨基酸對褐變度的影響由圖13可知，M4（賴氨酸）和M5（脯氨酸）的褐變度高于M7（不含氨基酸），而M6（谷氨酸）褐變度在前5天達到最高后基本不變，明顯低于M7，綠原酸、VC和葡萄糖的綜合作用能明顯促進褐變。脯氨酸是枸杞酒中質量濃度最高的氨基酸，對褐變具有明顯促進作用，賴氨酸對枸杞酒褐變影響次之。谷氨酸在枸杞酒模擬體系中，對褐變度具有較明顯抑制作用，其抑制機理有待研究。

圖13 不同氨基酸模擬體系褐變度的變化Fig.13 Changes of browning degree of different amino acids model systems

3 結語

在發酵過程中，酶促褐變和非酶促褐變同時存在，酶促褐變主要由PPO和POD催化枸杞發酵液中的酚類物質引起。主要酚類物質是蘆丁、綠原酸、羥基苯甲酸、阿魏酸、香豆酸，這些物質在酶的催化下形成具有高度氧化活性的鄰醌，并最終形成不溶性的褐色多酚-黑色素，使枸杞酒的黃化發展為褐化。陳釀過程中，以非酶褐變為主，主要來自多酚的氧化縮合和美拉德反應。總酚、總糖、脯氨酸、賴氨酸和谷氨酸是引起褐變的主要原因。