利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系統刪除34個非必需基因構建L-蘇氨酸生產菌

丁志祥，胡曉清，柳亞迪，王小元*，3

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 國際食品安全聯合實驗室，江蘇 無錫214122）

L-蘇氨酸是8種必需氨基酸之一，被廣泛應用于食品、飼料以及醫藥等領域，有著廣闊的市場前景[1]。L-蘇氨酸的生產方式主要是通過微生物發酵，并且大腸桿菌由于發酵周期短，遺傳背景清晰，便于基因改造，而成為了L-蘇氨酸生產的主要菌株[2]。大腸桿菌生產L-蘇氨酸涉及糖酵解、TCA循環和L-蘇氨酸生物合成途徑，見圖1。利用分子生物學技術來提高L-蘇氨酸的產量已成為熱門方向。thrA、thrB和thrC這3個基因都位于操縱子thrABC上，分別編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。將thrA的第1 034位堿基由C突變為T可解除蘇氨酸對其反饋抑制[1]。隨著操縱子轉錄水平的提高，ThrA、ThrB和ThrC 3種蛋白質的數量增加，從而使更多的碳流流向L-蘇氨酸合成途徑，L-蘇氨酸產量得以提高。如將含有誘變操縱子ThrA*BC的重組質粒PVIC40引入到脫敏大腸桿菌菌株MG442中時，L-蘇氨酸產量從8 g/L增加到18.4 g/L[3]。胞內合成的L-蘇氨酸經過由基因rhtA、rhtB、rhtC編碼的3種輸出蛋白質運送至胞外，但只有rhtC編碼的RhtC對L-蘇氨酸具有專一性[2]。由于賴氨酸、蛋氨酸或甘氨酸的生物合成被這些突變體阻斷，lysA、metA或tdh缺失突變體的L-蘇氨酸產量顯著增加[4]。將糖酵解通量改向戊糖磷酸途徑可減少乙酸積累并產生更多的NADPH，也可以增加L-蘇氨酸產量[5]。有研究表明，操縱L-蘇氨酸生物合成和旁路代謝途徑可提高L-蘇氨酸的產量[6-8]。在大腸桿菌以葡萄糖為碳源合成L-蘇氨酸的過程中，并不需要所有的基因發揮其功能，而這些基因仍然會利用碳源進行轉錄，且翻譯成相關蛋白質。作者所在實驗室有一株從土壤中篩選得到的高產L-蘇氨酸的大腸桿菌TWF001[1]，其基因組與野生型MG1655相比缺少puuE到ynaI之間的DNA分子片段。大腸桿菌基因組上puuE到ynaI之間的DNA分子長度為30.372 kb，包含pspFABCDE、ycjMNOPQRSTUV、ycjWXF3個操縱子和puuE、ymjB、ompG、tyrR、tpx、ycjG、mpaA、ymiC、ycjY、ycjZ、mppA和ynaI12個單基因，其中pspFABCDE操縱子編碼的噬菌體休克蛋白（Psp）系統負責修復內膜的損壞[9]；ycjMNOPQRSTUV操縱子和ompG被認為可能是大腸桿菌中的一種未知碳水化合物的潛在分解代謝途徑。近期也有研究表明，ycjQRS編碼的蛋白質可以將D-古洛糖苷轉化為D-葡萄糖苷[10]；由puuE基因所編碼的GABA轉氨酶可以將GABA轉化為琥珀酸半醛，通過敲除puuE基因可以提高GABA的產量[11]；tyrR編碼的TyrR蛋白是L-色氨酸生物合成和轉運相關基因的調節因子[12]；ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA編碼的蛋白質可以降解肽聚糖補充氮源來抵抗氮源饑餓環境[13]；而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚不清楚。通過對大腸桿菌基因組進行精簡，可以達到減少碳源損耗的目的。

圖1 大腸桿菌中L-蘇氨酸的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of L-threonine in E.coli

作者以大腸桿菌MG1655為出發菌株，結合CRISPR-Cas9技術[14]和位點特異性重組系統Cre/loxP[15]進行基因組大片段的敲除，構建了MG1655ΔpuuE-ynaI，將攜帶L-蘇氨酸操縱子的質粒pFW01-thrA*BC轉入突變株中，進行搖瓶發酵，結果表明缺失puuE到ynaI之間的DNA片段可以有效增加L-蘇氨酸的產量。并且發現在突變株中加強rhtC的表達，相比于加強rhtA的表達，L-蘇氨酸的增加更為明顯。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株與培養基出發菌株：大腸桿菌MG1655，作者所在實驗室保藏，相關突變株和質粒見表1。大腸桿菌細胞在37℃或30℃的Luria Bertani（LB）培養基（5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨和10 g/L氯化鈉）中以200 r/min的旋轉振蕩生長，LB固體培養基需另加16 g/L瓊脂粉。在培養和篩選過程中根據需要添加誘導劑或抗生素：異丙基硫代半乳糖苷（IPTG：0.5 mmol/L）、阿拉伯糖（30 mmol/L）、5-氯-2（2′，4′-二氯苯氧基苯酚）（100 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）、壯觀霉素（50 mg/L）、氨芐霉素（50 mg/L）。L-蘇氨酸的生產水平和生長特性通過發酵法進行測定，種子培養基為LB培養基。搖瓶發酵培養基：30.0 g/L葡萄糖，2.0 g/L酵母粉，25.0 g/L（NH4）2SO4，2.0 g/L 檸 檬 酸，7.46 g/L KH2PO4，2.0 g/L MgSO4·7H2O，5 mg/L FeSO4·7H2O，5 mg/L MnSO4·4H2O，20 g/L CaCO3，pH 6.8。115℃滅菌15 min[17]，上述試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

表1 本研究中使用的菌株和載體Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 實驗設備回旋式搖床（HYG-A）：上海知楚公司；液相色譜儀（Agilent 1260）：美國Agilent有限公司；核酸蛋白定量儀（GZNOVA）：英國Biochrom公司；實時熒光定量PCR儀（StepOnePlus）：美國Applied Biosystems公司；還原糖測定儀（SBA-40）：山東科學院生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因重組菌的構建本研究所用的引物見表2。引物主要根據大腸桿菌MG1655基因組序列設MG003菌株是用CRISPR-Cas9和Cre/loxp系統相結合的方法敲除基因puuE到ynaI之間的整個DNA片段。基因編輯進程中所用到的質粒圖譜見圖2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

圖2 本研究所用到的質粒pCas、pTargetF、pKD-Cre、pFW01-thrA*BC、pFW01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC的圖譜Fig.2 Maps of different plasmids pCas，pTargetF，pKDCre，pFW01-thrA*BC，pFW01-thrA*BC-rhtA and pFW01-thrA*BC-rhtC used in this study

1）MG001（MG1655puuE：：loxP）的構建 將loxP位點的13 bp反向重復序列設計在上下游同源臂的引物重疊區。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術首先在puuE的上游區插入loxP位點，上游同源臂和下游同源臂分別用引物loxP-puuEf1/loxPpuuEf2和loxP-puuEr1/loxP-puuEr2進行擴增，然后將上下游同源臂通過重疊PCR的方法連接成loxP-puuE打靶片段。質粒pTargetF-loxP-puuE是以原始質粒pTargetF為模板，用引物sgRNA-puuEF和T-sgRNA-R擴增得到線狀的pTargetF-loxPpuuE片段，再通過自連成環狀質粒pTargetF-loxPpuuE，引物T-puuE-F和T-sgRNA-R用來驗證質粒的正確性。然后將構建好的100 ng質粒pTargetF-loxP-puuE和500 ng打靶片段loxP-puuE電轉化到80μL的含有pCas的MG1655的感受態中，轉化子通過含有卡那霉素和壯觀霉素的LB雙抗平板進行篩選（pCas和pTargetF分別含有對卡那霉素和壯觀霉素具有抗性的基因），當在30℃烘箱中培養4 h后，用引物loxPf和loxP-puuEr2驗證重組菌株的正確性，pTargetF-loxP-puuE通過加入IPTG去除，因為IPTG可以激活質粒pCas中控制sgRNA-PMB1表達的lacIq啟動子，sgRNA-PMB1可以切割質粒pTargetF-loxP-puuE的PMB1片段。通過在42℃下過夜培養去除溫敏型質粒pCas。

2）MG002（MG1655puuE：：loxP，ynaI：：loxP）的構建 采用1.2.1的方法在ynaI的下游區插入loxP位點，上游同源臂和下游同源臂分別用引物loxPynaIf1/loxP-ynaIf2和loxP-ynaIr1/loxP-ynaIr2進行擴增，然后將上下游同源臂通過重疊PCR的方法連接成loxP-ynaI打靶片段。質粒pTargetF-loxP-ynaI是以原始質粒pTargetF為模板，用引物sgRNAynaI-F和T-sgRNA-R擴增得到線狀的pTargetFloxP-ynaI片段，再通過自連成環狀質粒pTargetFloxP-ynaI，引物T-ynaI-F和T-sgRNA-R用來驗證質粒的正確性，后續的步驟與1.2.1相同。

3）MG003（MG1655ΔpuuE-ynaI：：loxP）的構建通過1.2.2的方法，成功構建了含有兩個同向loxP位點的MG002菌株，將質粒pKD-Cre46電轉入MG002的感受態中，用含有氨芐抗性的LB平板進行篩選，轉化子再通過加入阿拉伯糖誘導Cre重組酶的表達，使兩個loxP位點之間發生重組，loxPpuuEf1和loxP-ynaIr2引物用來驗證轉化子的正確性。再通過42℃過夜培養去除pKD-Cre46得到所需的目的菌株MG003，菌株構建示意圖見圖3。UpuuE和DpuuE分別表示puuE基因的上下游同源臂，UynaI和DynaI分別表示ynaI基因的上下游同源臂。

圖3 大片段puuE-ynaIDNA片段敲除策略Fig.3 A strategy for generating deletion of large puuEynaIDNA fragment

1.2.2 搖瓶發酵先將凍干管菌液劃線于無抗的LB固體培養基上活化菌株，置于37℃的培養箱中過夜培養，再用接種環挑菌接種于裝有5 mL LB液體培養基的試管中，37℃、200 r/min培養4 h，接著轉接到二級種子搖瓶培養基中，初始OD600為0.1，37℃、200 r/min培養4 h，最后將上述培養液轉接到發酵培養基中，初始OD為0.2，37℃、200 r/min培養36 h，每隔6 h取一次樣。

1.2.3 發酵參數的測定

1）生物量的測定 發酵菌株的生物量通過紫外分光光度計進行測定，用1 mol/L的鹽酸稀釋至OD600=0.1～1之間。

2）葡萄糖質量濃度的測定 葡萄糖質量濃度通過SBA-40還原糖測定儀進行測定，待儀器定標以后，取1 mL發酵液在12 000 r/inm轉速下離心2 min，將上清液用去離子水稀釋100倍，混勻，測定葡萄糖質量濃度。

3）pH的測定 取1 mL發酵液在12 000 r/min離心2 min，將上清液置于pH計探頭下，顯示數值即為發酵液的pH。

4）氨基酸質量濃度的測定 樣品的前處理：取1 mL發酵液在12 000 r/min下離心2 min，取上清液50μL與950μL 5%的三氯乙酸混勻，置于4℃冰箱2 h以上，待上清液蛋白質沉淀后，12 000 r/min離心15 min，然后用0.22μm的水相針式濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為處理好的待測樣品。

使用高效液相色譜法測定氨基酸的質量濃度，方法為鄰苯二甲醛柱前衍生化法[18]。儀器為Agilent1200超高效液相色譜儀，色譜柱為ThermoODS-2HYPERSILC18 column（250 mm×4.0 mm，USA）。流動相：水相（3.01 g無水乙酸鈉溶解于超純水中，200μL三乙胺，5 mL四氫呋喃，用水定容至1 L，調pH至7.2）和有機相（3.01 g無水乙酸鈉溶解于200 mL超純水中，調pH至7.2，400 mL HPLC乙腈，400 mL HPLC甲醇）。UV檢測波長338 nm，流速1 mL/min，柱溫40℃。

5）乙酸質量濃度的測定 樣品的前處理：取1 mL的發酵液在12 000 r/min下離心2 min，取上清液300μL與300μL的去離子水混合均勻，12 000 r/min離心30 s，置于80℃水浴鍋15 min以上，待上清液蛋白質變性后，12 000 r/min再離心15 min，然后用0.22μm的水相針式濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為處理好的待測樣品。

采用高效液相色譜法測定乙酸質量濃度，儀器為Agilent1200超高效液相色譜儀，色譜柱為aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm），流動相為0.005 mol/L的稀硫酸，流量設置為0.6 mL/min，柱溫維持在50℃，紫外檢測波長為210 nm。

1.2.4 基因的轉錄水平分析采用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）對不同大腸桿菌株中ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB基因的mRNA進行定量分析。采用RNA提取試劑盒（中國北京，BioFlux）從對數生長中期的大腸桿菌細胞中提取總RNA。用核酸定量儀測定RNA的濃度，用4×gDNAwiper Mix（中國南京，Vazyme）從RNA樣品中去除殘留的DNA。再用5×HiScriptⅡqRTSuperMixⅡ（中國南京，Vazyme）將RNA反轉錄成cDNA。采用ABIStep OneRT-PCR系統（美國加利福尼亞州圣馬特奧市應用生物系統）和ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Mastet Mix（中國南京，Vazyme）進行RT-PCR。表2列出了本研究中使用的引物，采用RT-PCR程序為：95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；40個循環。根據周期閾值定量目標mRNAs的相對豐度，該閾值定義為獲得背景以上熒光信號所需的周期數，并根據2-ΔΔCT公式進行計算[19]。為了使結果標準化，采用16S rRNA相對豐度作為內部標準控制。

1.2.5 數據分析方法本研究中單項方差分析（oneway analysis of variance）被應用于數據分析[20]。單項方差分析也是一種最簡單的方差分析方法，以Excel為分析工具，OD600、葡萄糖消耗速率、L-蘇氨酸的合成、乙酸的形成和基因的轉錄水平之間的差異用單項方差分析得出p值，p小于0.05，表明顯著的差異。

2 結果與討論

2.1 大腸桿菌MG655基因組中34個非必需基因的刪除對菌株生長無明顯影響

從基因puuE的起始密碼子到ynaI的終止密碼子共有30.372 kb，用傳統的Red同源重組的基因編輯方法無法敲除，已有文獻報道位點特異性重組系統Cre/loxP可以進行大片段的敲除[21]，但通過普通的Red同源重組在基因組中引入兩個loxP位點并不容易。作者第一次將CRISPR-Cas9技術和位點特異性重組系統Cre/loxp結合進行大腸桿菌大片段DNA分子的敲除，因為CRISPR-Cas9基因編輯技術相對于傳統的Red同源重組有著更高的編輯效率。首先利用CRISPR-Cas9技術在puuE的上游區插入第一個loxP位點，采用1.2.1（1）驗證方法，正確插入loxP位點條帶大小為313 bp，見圖4泳道1。野生型無loxP結合位點，見泳道2。然后在ynaI的下游區插入第二個loxP位點，采用1.2.1中（2）驗證方法，正確插入loxP位點條帶大小為306 bp，見泳道3，野生型見泳道4。最后轉入質粒pKDCre46，使兩個loxP位點之間發生重組，采用1.2.1中（3）的驗證方法，突變株條帶大小為554 bp（見泳道5），野生型有30 kb左右，無法PCR出條帶。待DNA測序分析正確后，我們成功構建了MG003突變株。

圖4 MG001、MG002和MG003突變菌株構建驗證Fig.4 Verification of MG001，MG002 and MG003 mutant strains by PCR

為了研究大片段puuE-ynaI的缺失對菌株的生長特性的影響，我們以MG1655為對照菌，將MG003在LB培養基中進行生長曲線的測定。如圖5所示，在6 h前，MG003的生長一直優于野生型MG1655，但6 h后，生長變慢。在培養14 h后，MG003的OD600達到4.78，而野生型MG1655的OD600為5.03。兩菌株的pH變化趨勢并無明顯區別，都是3 h之前下降，3 h之后逐步上升。結果表明，大片段puuE-ynaI的缺失會略微影響菌株的生長，而不會影響生長過程中的pH。對數期生長的加快且最終OD600的降低有利于發酵生產L-蘇氨酸，因為對數期的加快可以縮短發酵周期，并且在不影響菌株活力的情況下，OD600的降低可以使更多的碳源合成我們所需要的目標產物。

圖5 MG003的生長曲線測定Fig.5 Measurement of growth curve of MG003

2.2 大腸桿菌基因組中34個非必需基因的刪除有利于L-蘇氨酸合成

基因puuE到ynaI之間的DNA分子含有操縱子pspFABCDE和ycjMNOPQRSTUV，還包括ymjB、ycjG等單基因片段。為了研究大片段puuE-ynaI對L-蘇氨酸發酵的影響，質粒pFW01-thrA*BC分別轉入到野生型MG1655和突變株MG003中。搖瓶發酵結果見圖6。MG003/pFW01-thrA*BC的生長明顯優于對照菌MG1655/pFW01-thrA*BC，并且葡萄糖消耗速率有略微提高。可能是由于基因組的精簡，導致更多的碳源用于生長。在發酵36 h后，L-蘇氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC中的產量達到0.64 g/L，相較于對照菌MG1655/pFW01-thrA*BC提高了25.5%。這些數據表明，大片段puuE-ynaI的缺失可以促進菌株的生長和提高L-蘇氨酸的產量。為了探究胞內代謝水平變化，發酵36 h后，我們也對副產物乙酸和中間代謝物丙酮酸進行了測定。如圖6（c）所示，與對照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC乙酸質量濃度下降7.5%，丙酮酸質量濃度上升9.3%。表明大片段puuE-ynaI的缺失降低了丙酮酸向乙酸的轉化率。

圖6 MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的搖瓶發酵Fig.6 Flask cultivation of MG1655/pFW01-thrA*BC and MG003/pFW01-thrA*BC strains

為了更好地解釋發酵過程中OD600、葡萄糖消耗、L-蘇氨酸和有機酸的質量濃度在MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的不同，對與L-蘇氨酸代謝的相關基因ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB的轉錄水平進行了測定。基因ppc的轉錄水平顯著上調，而pck略微上調，表明從磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸路徑被加強，而草酰乙酸是L-蘇氨酸合成的前體物質，aspC基因的略微上調可以將草酰乙酸更多的轉向L-天冬氨酸[22]，這正好解釋L-蘇氨酸的產量在MG003/pFW01-thrA*BC菌株中的增加。另一方面，基因gltA的轉錄水平上調可以促進更多的碳流從丙酮酸轉向TCA循環，而不是合成副產物乙酸[23]。基因aceA和aceB的轉錄水平有略微下調，表明乙醛酸循環并沒有由于大片段puuE-ynaI的缺失而激活。在大片段puuE-ynaI之間的DNA分子中，基因puuE和tyrR被分別報道與GABA和L-色氨酸合成相關[11-12]；基因ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA都與肽聚糖的降解相關[13]。操縱子pspFABCDE與內膜修復相關[9]，操縱子ycjMNOPQRSTUV被認為作用于未知碳水化合物的分解代謝[10]，這些已知的功能與L-蘇氨酸的合成并無直接聯系。而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚未被完全揭開。在本研究中，我們證明了大片段puuE-ynaI的缺失并不會損害菌株的生長性能，反而能提高L-蘇氨酸的合成能力。

2.3 通過加強L-蘇氨酸的外轉運進一步提高L-蘇氨酸產量

為了進一步增加L-蘇氨酸的產量，在MG003中分別轉入pFW 01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC，構建菌株MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC。以MG003/pFW01-thrA*BC為對照，將MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC進行搖瓶發酵。如圖7所示，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA的生長和糖耗與對照菌MG003/pFW01-thrA*BC無明顯區別，而MG003/pFW01-thrA*BCrhtC在發酵前中期生長慢于MG003/pFW01-thrA*BC，葡萄糖消耗速率也隨之降低。但是發酵36 h后，L-蘇氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC分別達到了0.73、0.89 g/L。較MG003/pFW01-thrA*BC分別提高了15.8%和36.5%。這些結果表明，rhtA和rhtC的加強都可以增加L-蘇氨酸的產量，但rhtC增加的效果更明顯，RhtA并不是特異性L-蘇氨酸輸出蛋白質，它還可以向胞外轉運L-絲氨酸，而RhtC底物專一性更好，只能轉運L-蘇氨酸[24]。為了進一步探究加強rhtA和rhtC的表達對胞內代謝水平的影響，發酵36 h后，對副產物乙酸和中間代謝物丙酮酸進行了測定。與對照菌MG003/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA乙酸質量濃度無明顯變化，丙酮酸略微降低；而MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC中乙酸和丙酮酸質量濃度都顯著降低，分別為8.49、0.34 g/L，下降了15.5%和67.6%。表明加強rhtC的表達更能促進碳流從丙酮酸轉向TCA循環來積累L-蘇氨酸，而不是合成副產物乙酸。

圖7 MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的搖瓶發酵Fig.7 Flask cultivation of MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA and MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC strains

3 結語

通過利用CRISPR-Cas9和系統Cre/loxP系統對大腸桿菌puuE-ynaI之間34個非必需基因進行敲除，構建了菌株MG003。通過高表達L-蘇氨酸合成途徑中關鍵基因thrA*、thrB和thrC以及L-蘇氨酸轉運酶編碼基因rhtA和rhtC提高L-蘇氨酸產量。與對照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC生長加快，L-蘇氨酸產量提高25.5%；MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-蘇氨酸產量提高了43.3%；MG003/pFW01-thrA*BCrhtC的L-蘇氨酸產量提高了74.5%。研究發現，大片段puuE-ynaI的缺失可以增強ppc和gltA基因的轉錄水平，基因ppc轉錄水平的提高可以增加L-蘇氨酸的前體物質草酰乙酸的質量濃度，基因gltA的轉錄水平提高可以增加TCA循環通量，從而促進菌株的生長。基因aspC的轉錄水平也略微提高，這些正好可以解釋在突變株MG003中L-蘇氨酸的產量的增加。加強rhtA和rht C的表達都可以進一步增加L-蘇氨酸的產量，但rhtC增加更為明顯，并且乙酸和丙酮酸質量濃度都顯著降低，更加有利于L-蘇氨酸的積累。作者通過敲除34個非必需基因提高了L-蘇氨酸的產量，此外在大腸桿菌基因組中還有很多非必需基因簇，通過大腸桿菌基因組精簡，減少碳源的非必需消耗，也可以用來提高其他目標代謝產物的產量，并且對工業化菌株的改造具有指導意義。