甜菊醇調控巨噬細胞ABCA1蛋白表達

李 妍，楊艷宇，劉婷婷，李 月，李 成*

（1.大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連116034；2.營口市環境監測站，遼寧 營口115000）

甜菊糖作為一種天然甜味劑，是從甜葉菊中提取的一種低熱量的天然甜味劑，對高血壓、糖尿病、肥胖病等具有治療作用[1-4]。有研究表明，甜菊糖喂養的小鼠，其體內膽固醇及血糖等指標有不同程度的下降，認為甜菊糖對動脈粥樣硬化導致的疾病具有重要的調控作用[5-6]。動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病、腦梗死、外周血管病等相關心腦血管類疾病的重要成因[7-8]。研究表明，當血管內的巨噬細胞不斷吞噬膽固醇后，出現“泡沫化”現象，形成泡沫細胞，泡沫細胞滲透到動脈壁后，細胞內膽固醇釋放，促進AS的病程發展[9]。介導巨噬細胞內膽固醇流出的主要蛋白質是ABCA1蛋白，它能夠有效介導巨噬細胞膽固醇的外流，對巨噬細胞內膽固醇流出的調節起關鍵作用[10-12]。因此，尋找能夠提高ABCA1蛋白表達的小分子藥物前體，對AS的預防及治療都具有非常重要的意義。

研究表明，甜菊糖在機體消化道的下段會被盲腸內微生物分解為甜菊醇[3]。因此，研究人員認為，甜菊糖被食用后，甜菊醇是其進入機體并參與代謝系統的主要化學成分。據此推測，甜菊醇作為甜菊糖的衍生物，是調控機體膽固醇代謝的主要物質[13]，但其使用條件尚不明確。作者以小鼠巨噬細胞J774A.1為模型，檢測了甜菊醇對膽固醇轉運重要蛋白ABCA1表達的影響，初步探討了甜菊醇調控ABCA1的作用機制，為后續治療和預防AS奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料小鼠單核巨噬細胞J774A.1：上海富衡生物有限公司。

1.1.2 主要試劑DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）、25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素：Gibco公司；CPT和STE：Sigma公司；NP-40裂解液、蛋白酶抑制劑、PMSF、DAPI染色液、Alexa Fluor 555熒光二抗、抗熒光猝滅劑、山羊血清工作液、ECL顯影液：上海碧云天公司；qRT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒：北京天根有限公司；兔抗鼠PPAR-α一抗、HRP標記的山羊抗兔IgG、兔抗鼠β-actin一抗、兔抗鼠ABCA1一抗、兔抗鼠LXRα一抗：北京全式金公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器MultiskanGo酶標儀：Thermo Scientific（中國）公司；CO2細胞培養箱：三洋電機株式會社；倒置熒光顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR：羅氏診斷產品（上海）有限公司；Tanon-5200Multi凝膠成像儀：上海天能科技有限公司。

1.1.4 引物利用Primer 5.0軟件分別設計反轉錄內參引物qT-GADPH、qT-ABCA1、qT-LXRα、qTPPARγ、qT-PPARα的熒光定量PCR引物，特異性引物序列見表1。

表1 各個基因的引物序列Table 1 Sequence of different primers

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將小鼠單核巨噬細胞J774A.1在10%胎牛血清的DMEM培養液（100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素）中進行培養，置于體積分數5%CO2，飽和濕度為100%的恒溫細胞培養箱中孵育培養，每48小時換一次液，細胞密度達80%以上時進行一次傳代，使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況。

1.2.2 CPT處理小鼠巨噬細胞J774A.1設置了6個CPT濃度梯度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L），與小鼠巨噬細胞J774A.1細胞共同孵育24 h，以DMEM培養基處理的細胞作對照組，利用MTT[14]檢測CPT對細胞活性的影響。

1.2.3 STE處理小鼠巨噬細胞J774A.1確定了CPT的添加濃度后，不同濃度的STE（5、10、25、50、75、100、125μmol/L）處理24 h后，MTT法分析其對小鼠巨噬細胞（J774A.1）活性的影響。

1.2.4 反轉錄獲得cDNA第一鏈4℃、3 000 r/min離心5 min后收集細胞。采用天根微量樣品總RNA提取試劑盒提取各個處理組細胞樣品的總RNA[15]。瓊脂糖電泳鑒定后，參照反轉錄試劑盒的使用說明，以細胞總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA第一鏈。

1.2.5 熒光定量PCR檢測目標基因的表達情況以各組的cDNA為模板，利用熒光定量PCR法檢測ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα的表達情況，內參基因為GADPH。其中，反應條件95℃，20 s；Tm根據各組引物的退火溫度確定；56℃，20 s；72℃，20 s；40個循環，采用2-△△CT法計算各個基因的相對表達量[16]。

1.2.6 提取細胞全蛋白質每組細胞樣品加入80 μL裂解液（2%NP40中加入蛋白酶抑制劑、EDTA、3μL 100 mmol/L PMSF），冰上重懸細胞，靜置30 min。13 000 r/min離心收集上清液。采用凱基BCA蛋白質含量檢測試劑盒（BCA法），對獲得的全蛋白質提取物進行蛋白質定量。

1.2.7 免疫蛋白印記檢測目標蛋白質的表達情況取各組樣品的全蛋白質提取物，進行SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜后，進行免疫蛋白印記（Western-Blot）檢測ABCA1、LXRα和PPARα的表達情況。凝膠成像儀分析免疫印跡條帶的相對灰度值，以反映各個蛋白質的相對表達量，每組相對灰度值的計算以β-actin蛋白作為內參。

1.2.8 免疫熒光技術檢測目標蛋白質在細胞內的表達情況各組細胞用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次后加入0.1%Triton X-100處理10 min，加入山羊血清工作液（5%），濕盒內室溫封閉2 h后加入稀釋好的一抗（1∶200兔抗小鼠，3%山羊血清工作液），4℃過夜孵育。加入稀釋好的Alexa Fluor 555熒光二抗（1∶2 500）后，室溫、避光孵育1 h。DAPI（每孔10μL）復染細胞核15 min后，滴加抗熒光猝滅劑，各組樣品置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.9 統計學分析采用SPSS軟件對數據進行分析處理[17]。兩組間數據比較采用單因素T檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析。以p＜0.05（*）表示數據間差異顯著，p＜0.01（**）表示數據間差異極顯著。數據中的誤差線表示至少3個生物學重復的標準誤差。

2 結果與分析

2.1 單獨的STE不能調控J774A.1細胞ABCA1的表達

檢測了STE對J774A.1細胞ABCA1蛋白表達的調控作用。首先檢測了STE對細胞的毒性作用。MTT檢測結果發現，在較大的濃度范圍內（0～100 μmol/L），STE對小鼠巨噬細胞幾乎無毒性；125 μmol/L的STE作用于巨噬細胞時，J774.1細胞出現了一定程度的死亡，存活率為87.1%（p＜0.05），見圖1（a）。選取適中濃度的STE（50μmol/L）進行后續實驗，結果見圖1（b）。和對照組比較，50μmol/L STE處理的細胞的ABCA1的表達量沒有出現明顯的變化。這表明，單獨的STE不會影響小鼠巨噬細胞J774A.1上ABCA1的表達。

圖1 STE對小鼠巨噬細胞（J774A.1）活性的影響以及STE對ABCA1蛋白表達的調控Fig.1 Effects of STE on the activity of mouse macrophages J774A.1 and the function of STE on the expression of ABCA1

2.2 確定STE/CPT的使用濃度

因為甜菊醇可以降低小鼠腸道細胞的ATP含量[6]，從而影響第二信使cAMP，而ABCA1的表達會受cAMP含量的影響。基于上述原因，在使用STE的同時，將加入cAMP類似物CPT[18]來調控胞內的cAMP水平。利用MTT法首先確定了CPT可使用濃度，結果見圖2（a）。在較低的CPT濃度范圍時（≤0.8μmol/L），CPT的添加未對細胞造成任何損傷和毒性。當CPT濃度升至1.0μmol/L時，J774A.1細胞出現了一定程度的損傷。基于MTT結果，確定0.2～0.8μmol/L的CPT濃度均可用于后續研究，作者選擇0.4μmol/L的CPT與STE共同處理細胞。

圖2 CPT和CPT/STE對J774A.1細胞活性的影響Fig.2 Effects of CPT and CPT/STE on the activity of J774A.1

在添加CPT的基礎上，引入不同濃度（0、5、10、25、50、75、100、125μmol/L）的STE。由于CPT和STE的共同引入，對小鼠巨噬細胞J774A.1的活性均有一定的毒副作用。當STE為5～50μmol/L時，細胞的活性＞90%；隨著STE濃度的增加（75～125 μmol/L），細胞的活性降至對照細胞活性的70%左右，見圖2（b）。選取50μmol/L STE和0.4μmol/L CPT共同處理細胞，研究其對小鼠巨噬細胞ABCA1蛋白表達的作用。

2.3 STE/CPT上調J774A.1細胞ABCA1蛋白的表達

設置了4個實驗組，Western blot檢測不同處理條件下小鼠巨噬細胞內ABCA1的表達情況，結果見圖3。與對照組相比，單獨STE不能影響ABCA1的表達。CPT處理后，ABCA1的表達出現上調，灰度值約是對照組的2.8倍（p＜0.05）。STE/CPT處理組細胞內ABCA1的表達大幅上調，灰度值約是對照組的20倍（p＜0.01）。免疫印跡結果初步表明，在CPT的基礎上，STE可以顯著上調小鼠巨噬細胞內ABCA1在蛋白質水平的表達。

圖3 Western blot檢測ABCA1蛋白的表達Fig.3 Expression of ABCA1 protein detected by western blot

進一步利用細胞免疫熒光技術在細胞水平直接檢測ABCA1的蛋白質表達情況，結果見圖4。其中，藍色熒光為DAPI染色后的細胞核，紅色熒光為Alexa Fluor 555二抗特異識別的ABCA1蛋白。結果表明，對照組細胞和單獨STE處理的細胞內，ABCA1的表達量相對較低，視野內沒有出現明顯的紅色熒光；CPT處理后，細胞內依稀可見紅色熒光，但強度較弱；當用STE/CPT處理時，胞內紅色熒光的強度明顯增加，見圖4。細胞免疫熒光的結果與Western Blot幾乎一致，即單獨的STE對小鼠巨噬細胞J774A.1上ABCA1的表達沒有明顯的調控作用，但是在CPT的基礎上，STE的添加可以顯著增加ABCA1在蛋白質水平的表達。

圖4 免疫熒光檢測細胞（J774A.1）上ABCA1蛋白的表達情況Fig.4 Expression of ABCA1 protein in J774A.1 cells detected by immunofluorescence

熒光定量PCR進一步檢測STE對ABCA1蛋白在mRNA水平的調控作用，結果見圖5。相較于對照組，單獨STE處理時，細胞ABCA1的mRNA水平沒有明顯變化；單獨的CPT處理時，細胞內ABCA1的表達量出現了明顯上調，約是對照組的19.4倍左右（p＜0.05）；但是，當細胞以STE/CPT共同處理時，相較于其它組別，ABCA1的mRNA水平大幅度上調，是對照組的36.9倍左右（p＜0.01）。這表明在CPT的基礎上，STE也能提高小鼠巨噬細胞ABCA1在mRNA水平上的表達。

圖5 熒光定量PCR檢測細胞（J774A.1）中ABCA1蛋白的mRNA表達情況Fig.5 Expression of ABCA1 mRNA detected by QRTPCR

結果表明，單獨STE不能調控ABCA1的表達，可能是細胞內ATP轉化被抑制，降低了cAMP的濃度，從而影響了細胞信號通路的轉導過程；而CPT的添加可以抵消STE對細胞能量轉化途徑的負作用。同時，在CPT的基礎上，STE能顯著提高小鼠巨噬細胞（J774A.1）ABCA1蛋白在蛋白質及mRNA水平上的表達。

2.4 STE調控ABCA1表達機制的初步探討

ABCA1在體內受多種因素調節，研究發現，LXRα和PPAR家族受體被認為是調控ABCA1基因表達的主要核受體[19]。LXRα主要是通過和視黃醇類X受體RXR組成的異源二聚體LXR/RXR來識別ABCA1基因啟動子上的DR-4元件，進而啟動ABCA1的表達[20]。PPAR家族受體不能直接調控ABCA1基因啟動子的表達，而是通過LXRα進行間接調控，因此PPAR→LXRα是研究較多的ABCA1調控通路。

Western Blot和qRT-PCR檢測發現，STE/CPT均能上調LXRα在蛋白質和mRNA轉錄水平的表達，結果見圖6。在蛋白質水平上，單獨STE處理后細胞內LXRα沒有出現明顯變化；CPT可以提高LXRα蛋白的表達量約3倍（p＜0.01）；當STE/CPT共同作用后，LXRα的表達量是對照組的4倍左右（p＜0.01），見圖6（a）。在mRNA水平上，相比于對照組和STE處理組，CPT處理時，LXRα的mRNA水平約是對照組的3.6倍（p＜0.05）；STE/CPT共同處理時，LXRα的mRNA水平顯著提高，約是對照組的5.2倍（p＜0.01），見圖6（b）。這表明STE/CPT能在mRNA和蛋白質水平上顯著提高ABCA1上游調控因子LXRα的表達。

圖6 STE/CPT共同作用對LXRα蛋白和mRNA表達水平的影響Fig.6 Effect of STE/CPT on the expression of LXRα protein and mRNA

研究發現，PPARs家族受體能夠調控膽固醇的有兩個成員，PPARα和PPARγ，LXRα是二者下游的靶基因[21]。熒光定量檢測結果發現，STE/CPT共同處理24 h后，PPARγ的mRNA表達沒有出現變化，即STE/CPT不能調控PPARγ的表達水平，見圖7。

圖7 STE/CPT共同作用對PPARγmRNA表達的影響Fig.7 Effect of STE/CPT interaction on PPARγmRNA expression

進一步分析了STE/CPT對PPARα表達的影響，結果見圖8。相較于對照組，單獨CPT處理時，細胞內PPARα的表達量出現了明顯上調，是對照組的4倍左右（p＜0.05）；當細胞以STE/CPT共同處理時，單獨的STE和單獨CPT處理組中，PPARα的mRNA水平顯著上調，約是對照組的5.13倍（p＜0.05），見圖8（a）。因此，STE/CPT共同處理后，可以在轉錄水平上顯著提高調控因子PPARα的表達水平。Western Blot結果表明，單獨的STE處理不影響PPARα蛋白的表達量，單獨CPT處理使PPARα蛋白的表達量提高了2倍多。STE/CPT共同作用后，PPARα蛋白表達量約是對照組的3.4倍（p＜0.01），見圖8（b）。這表明，STE/CPT可以顯著提高小鼠巨噬細胞J774A.1 PPARα在蛋白質水平上的表達。

圖8 STE/CPT共同作用對PPARαmRNA和蛋白質表達水平的影響Fig.8 Effects of STE/CPT on the expression of PPARα mRNA and protein

綜上所述，初步推測STE/CPT能上調ABCA1的表達可能是通過PPARα-LXRα-ABCA1的通路途徑。

3 結語

膽固醇是細胞膜的重要組成部分，在機體的信息傳遞、膽汁酸合成以及激素合成中扮演著重要的角色。目前心腦血管類疾病的發病率一直居高不下，然而過多的膽固醇會引發動脈粥樣硬化性疾病。機體對膽固醇分泌的調節機制非常復雜，其中膽固醇逆轉運是機體膽固醇代謝的重要途徑，也是近年來國內外研究的熱點。ABCA1在膽固醇的逆轉運過程中具有重要作用，如果能夠根據機體脂肪代謝的需要，有效地調節ABCA1的表達水平，對機體的脂代謝和AS的治療具有重要意義。

甜菊糖，又稱甜菊糖、甜菊糖苷，是從植物甜葉菊中提取的新型天然甜味劑。國外早有使用甜葉菊作為藥草和代糖的歷史。我國是甜菊糖的主要生產國。目前，甜菊糖已在世界各地廣泛應用于食品、飲料、調味料的生產。甜菊糖的熱量極低，攝入人體后不被吸收，也是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。研究表明，甜菊糖兼具有藥理活性，能夠預防動脈粥樣硬化、高血糖、高血壓等疾病，還可以作為免疫增強劑使用[22-24]。研究發現，甜菊糖會被腸道內的微生物降解為甜菊醇，部分甜菊醇會被腸道吸收，經由肝臟，然后通過血液，最后從腎臟排出體內[25]。據此推測甜菊糖的許多生理功與甜菊醇具有密切關系。研究發現，STE可以有效地調節小鼠巨噬細胞ABCA1的mRNA和蛋白質的表達水平，這一結果給AS相關疾病藥物的開發提供了相關的理論依據。

由于甜菊醇可以降低小鼠腸道細胞對葡萄糖的吸收，從而降低腸道細胞內的ATP含量；另外，甜菊醇對細胞的呼吸鏈也有明顯的抑制作用，從而使胞內ATP的生成和轉化出現抑制，降低了其ATP含量[6，26-28]。我們知道，細胞內重要的第二信使cAMP來源于ATP的轉化，當胞內ATP下降時必然會導致cAMP的轉化受阻，而ABCA1的表達與胞內cAMP的水平密切相關。研究發現cAMP及其類似物會調控巨噬細胞RAW264的質膜蛋白ABCA1的表達[29]。基于上述原因，我們推斷，甜菊醇的加入應該通過抑制ATP的形成，從而影響了胞內cAMP的生成，使ABCA1的表達受到抑制。本研究也證實了單獨的CPT同樣也可以顯著上調小鼠巨噬細胞ABCA1的表達水平。基于上述原因，在使用STE的同時，加入cAMP類似物CPT來調控胞內cAMP水平。STE必須在添加了cAMP類似物CPT的基礎上，才能顯著提高巨噬細胞膽固醇轉運蛋白ABCA1的表達水平。

ABCA1在體內受多種因素調節，包括上調ABCA1基因表達的LXR家族受體、PPAR家族受體和炎癥因子TGF-β，以及下調ABCA1基因表達的TNF-α、IL-1β和TNFγ等，其中LXR家族受體被認為是調控ABCA1基因表達的主要核受體[19]。研究發現，STE/CPT能夠上調機體重要的核轉錄受體LXRα蛋白的表達。PPAR家族受體也是研究較多的調控因子，近期有研究發現，仙人掌多糖能夠通過PPARγ→LXRα途徑調控ABCA1的表達[30]。我們前期也檢測了STE對PPARγ受體表達的影響，但是結果發現，STE不能調控PPARγ的表達。因為PPAR是一個成員眾多的受體家族，PPARs家族受體PPARα也能參與機體的膽固醇的調控。進一步結果表明，STE能夠上調機體重要的核轉錄受體PPARα在蛋白質水平和mRNA水平的表達。基于上述結果，我們初步推測，STE/CPT能夠上調ABCA1的表達可能是通過PPARα-LXRα-ABCA1的通路途徑。